معلومة

15.2: تحليل التحكم الأيضي - علم الأحياء

15.2: تحليل التحكم الأيضي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مقدمة في تحليل التحكم الأيضي

قد تبدو حركية الإنزيم صعبة نظرًا للاشتقاقات الرياضية المعقدة ، وعدد الأنواع الكيميائية المعنية (إنزيم وجميع ركائزه ومنتجاته) ، وعدد الخطوات في الآلية ، والعدد الكبير من ثوابت المعدل والحركية والانفصال. فيما يلي مثال على مثل هذا التفاعل "المعقد" الذي تم استكشافه مسبقًا:


لكن نادراً ما تعمل الإنزيمات المفردة بمعزل عن غيرها. إنها مكونات لمسارات معقدة لها العديد من الخطوات ، وكثير منها منظم. لفهم رد الفعل بشكل كامل ، من المهم دراسة تركيزات جميع الأنواع في المسار بأكمله كدالة للوقت. تخيل اشتقاق المعادلات وتحديد جميع التركيزات والثوابت ذات الصلة لمسار مثل تحلل السكر!


لدراسة حركية الإنزيم في المختبر ، عليك قضاء الكثير من الوقت في تطوير فحوصات لقياس كيفية تغير تركيز الأنواع كدالة زمنية لتتمكن من قياس السرعات الأولية للتفاعل المحفز بالإنزيم. ومع ذلك ، في شبكات التفاعلات الأيضية المتصلة ، قد لا يتغير تركيز بعض الأنواع في النظام. كيف يمكن أن يحدث هذا؟ قد يساعد مثالان بسيطان في شرح كيفية القيام بذلك.


مثال 1: لا يوجد أي مدخلات أو مخرجات من تفاعل معين. قد يحدث هذا في نظام مغلق لتفاعل قابل للانعكاس عند التوازن.

من أجل رد فعل عكسي للمتفاعل R الذي ينتقل إلى المنتج P مع ثوابت معدل الدرجة الأولى للأمام والعكس ، يمكن كتابة المعادلة التالية عند التوازن:

عند التوازن ، لا يتغير R و P.

مثال 2: ضع في اعتبارك رد الفعل كجزء من مسار التفاعلات (مثل نظام مفتوح). تخيل الآن إدخالًا غير صفري لتكوين المتفاعل R ومخرج غير صفري يستهلك المنتج P. إذا كانت معدلات الإدخال والإخراج متماثلة ، فلن تتغير تركيزات R و P بمرور الوقت. هذا هو معدل تكوين المادة المتفاعلة R لتفاعل معين يساوي المعدل الذي يستخدم عنده المنتج P للتفاعل المعطى. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى حالة مستقرة ولكن ليس تركيز التوازن للأنواع.

يتطلب فهم إنزيم نقي في المختبر وفي الجسم الحي طرقًا مختلفة. يحب علماء الكيمياء الحيوية عزل إنزيم موجود في بعض الأنسجة وتنقيته للتجانس ودراسة آلية عمله. عند القيام بالقياسات الديناميكية الحرارية لقياس ثوابت التوازن (K.مكافئ) أو ثوابت التفكك (K.د) ، ومنها ΔG0 يمكن حسابها ، عادةً ما يتم الاحتفاظ بتركيز البروتين ثابتًا نظرًا لتنوع تركيز الرابطة الرابطة (متغير مستقل). يتم قياس إشارة متغيرة تابعة (غالبًا ما تكون طيفية). يتم إجراء القياسات عند الوصول إلى التوازن.

بالنسبة للقياسات الحركية للإنزيم في المختبر ، عادةً ما يظل تركيز الإنزيم ثابتًا بينما تتنوع الركيزة والمعدلات (المتغيرات المستقلة) لتحديد كيفية تغير السرعة (المتغير التابع). يتم تحديد السرعة من خلال تركيز الركيزة. عند دراسة التثبيط ، تتنوع الركيزة بينما يظل المثبط ثابتًا عند عدة تركيزات ثابتة مختلفة.

في الجسم الحي ، يتم تحديد تركيز الركيزة وحتى تركيز الإنزيم بالسرعة. قارن مرة أخرى هذا مع الخواص الحركية في المختبر عندما تحدد التركيزات السرعة
بالنسبة لمجموعات التفاعلات في المسارات ، من الأفضل استخدام مصطلح التدفق ، J. في الحالة المستقرة ، تكون التدفقات الداخلة والخارجة لتفاعل معين متطابقة. يستخدم Flux J لوصف معدل النظام في حين أن المعدل أو السرعة v المستخدمة لوصف معدل إنزيم فردي في النظام.


يمكن لبرامج الكمبيوتر أن تجد تركيزات حالات ثابتة من خلال إيجاد جذور المعادلات التفاضلية العادية (ODE) عند ضبطها على صفر (vF = vص). لنمذجة عملية بتركيزات منخفضة جدًا ، يمكن للبرامج أيضًا استخدام المحاكاة الاحتمالية أو العشوائية لنمذجة توزيعات الاحتمالية للأنواع وتغيرها مع مرور الوقت لعدد محدود من الجسيمات. في مثل هذه المحاكاة ، يتم وضع التركيزات (مم) مع عدد الجسيمات. لا تعمل ODE بشكل جيد لوصف هذه الظروف لأن التغيرات في التركيزات ليست مستمرة.


نعود الآن إلى سؤالنا الخطابي السابق حول اشتقاق المعادلات وتحديد جميع التركيزات والثوابت ذات الصلة لمسار مثل تحلل السكر! في الواقع تم إجراؤه بواسطة Teusink et al لتحلل السكر في الخميرة. في الواقع ، تم تصميم العديد من مسارات التمثيل الغذائي ونقل الإشارات المعقدة رياضيًا على أمل فهم الاستجابات الخلوية والكائنات بشكل أفضل. تعد النمذجة الكمية والتنبؤ بالمدخلات والمخرجات والتركيزات لجميع الأنواع في المسارات المعقدة أساس بيولوجيا الأنظمة.

المبادئ الأساسية لتحليل التحكم الأيضي

هناك حاجة إلى مجموعة متنوعة من المدخلات لمثل هذه التحليلات الحسابية:

أ. مسارات محددة. هذه متوفرة في العديد من قواعد البيانات. فيما يلي أمثلة من مسارات KEGG لتحلل السكر بالخميرة

ب. برنامج نمذجة حسابية لإدخال جميع المعلمات والمعادلات والنماذج وحساب التركيزات لجميع الأنواع كدالة للوقت. تتضمن البرامج المجانية القابلة للتنزيل COPASI و Virtual Cell و Cell Designer. فيما يلي مثال لنموذج معيّن من Cell Designer لتحلل الخميرة مع العديد من التفاعلات الإضافية المتفرعة عن مسار التحلل الكلاسيكي.

كانت النتائج الحسابية من تحليلات تحلل الخميرة قادرة على ملاءمة البيانات التجريبية فقط إذا تم تصحيحها بإضافة عدة تفاعلات متفرعة (كما هو موضح في الأشكال أعلاه وأدناه):

ج. قائمة بجميع الأنواع المشاركة في المسار (كما هو موضح في الشكل أدناه لتحلل السكر وتفاعلات المتفرعة).

د. قائمة بجميع التفاعلات (الموضحة أدناه لتفاعلات تحلل السكر والتفاعلات المتفرعة ، مأخوذة من COPASI)


ه. معلمات من جميع الأنواع. يتم عرض مثال أدناه لـ hexokinase (مأخوذ من COPASI).

F. المعادلات التي يمكن استخدامها لحساب التغيير في تركيزات جميع الأنواع مع مرور الوقت. عادة ما تكون هذه معادلات تفاضلية عادية (ODE) كما هو موضح في الفصل 6 ب - حركية التفاعلات البسيطة والمحفزة بالإنزيم ، الأقسام ب 1: ردود الفعل أحادية الخطوة.) من السهل كتابة المعادلات التفاضلية ، ولكنها تتطلب جهاز كمبيوتر لحلها مع زيادة عدد الأنواع المتفاعلة .


يرد أدناه مثال لتفاعل كيميائي ومجموعة من ODE لكل نوع.

إذا أدى التفاعل إلى إزالة النوع X ، فإن الجانب الأيمن من ODE لاختفاء هذا النوع له علامة - لهذا المصطلح. وبالمثل ، إذا زاد رد الفعل من الأنواع X ، فإن الجانب الأيمن له علامة +. تُظهر الأمثلة المذكورة أعلاه تفاعلات أحادية الجزيء (C إلى D ، C إلى A + B) وثنائية الجزيء (A + B إلى C).


يظهر أدناه مثال على ODE مأخوذ من COPASI للتغير في تركيز الجلوكوز 6 فوسفات.

تم تطوير قواعد البيانات التي تحتوي على نماذج منسقة مع جميع المعلومات المذكورة أعلاه للعديد من المسارات. تم العثور على نموذج تحلل السكر في الخميرة الموصوف أعلاه في قاعدة بيانات النماذج الحيوية. يمكن تنزيل النموذج ، BIOMD0000000064 ، كملف لغة ترميز بيولوجيا الأنظمة (SBML) واستيراده في أي من البرامج الموضحة أعلاه.
توضح الرسوم البيانية أدناه تركيزات كل الأنواع كدالة زمنية لتحلل الخميرة باستخدام COPASI.

تحليل التحكم الأيضي وتثبيط الإنزيم البسيط

يقوم علماء الكيمياء الحيوية بنمذجة التفاعلات المعقدة المحفزة بالإنزيم في وجود وغياب المعدلات (سواء المنشطات أو المثبطات) لتطوير آليات للتفاعلات. يتم تحديد المعلمات الحركية التالية بشكل تجريبي من خلال تركيب السرعة الأولية (vo) مقابل تركيز الركيزة ([S]) من خلال خوارزميات التركيب غير الخطية.

  • كم - ثابت ميكايليس ، تركيز الركيزة عند نصف السرعة القصوى ؛
  • الخامسم - السرعة عند تشبع تركيز الركيزة ؛
  • كقط - رقم الدوران لتحويل المادة المتفاعلة المرتبطة إلى منتج ؛
  • كالتاسع - ثوابت تفكك التثبيط.


يوضح مثال على التثبيط التنافسي نوعًا شائعًا من التحليل لمثل هذه التفاعلات.

يظهر أدناه تصوير مصور حديث لتفاعل بسيط لا رجعة فيه محفز بالإنزيم للركيزة S التي تنتقل إلى المنتج P مع تثبيط بواسطة المنتج وبواسطة مثبط إضافي:

ضع في اعتبارك التفاعل البسيط المحفز بالإنزيم من أجل تحويل قابل للانعكاس من الركيزة S إلى المنتج P الذي يحتوي على 3 خطوات قابلة للعكس.

إذا كانت خطوات التفاعل الكيميائي للأمام (f) والعكس (r) (التفاعلات 2 و -2) لا رجعة فيها وكُتبت بشكل منفصل ، فيمكن كتابة معادلات Michaelis-Menten البسيطة لكل منها

بالنسبة لردود الفعل العكسية الفعلية للخطوة 2 ، لا يمكن العثور على صافي المعدل الآجل بطرح بسيط للمعادلتين أعلاه لأن المعادلات التفاضلية التي تصف المعدلات البسيطة إلى الأمام والعكس لا تأخذ في الاعتبار الخطوات العكسية

يمكن عمل اشتقاق بسيط (بافتراض توازن سريع لكل من الخطوات الأمامية والعكسية) لصافي التفاعل إلى الأمام. ضع في اعتبارك مرة أخرى تفاعل الإنزيم المحفز التالي:

قد تتذكر أنه بالنسبة لتفاعلات E + S <----> ES المعزولة وتفاعلات E + P <----> EP ، فإن ثوابت التفكك البسيط ، Kس وكص أعطيت من قبل

ينص افتراض التوازن السريع على أن معدل تفكك ES و EP ، وكلاهما خطوات فيزيائية ، أسرع بكثير من معدل خطوات التحويل الكيميائي لكل معقد. وبالتالي k-1 >> k2 و k3 >> k-2 ، لذلك يمكن تحديد الكميات النسبية لـ ES و EP من ثوابت التفكك كما هو موضح أعلاه.

يعطي الحفظ الشامل للإنزيم

من هذا يمكننا الحصول على المبلغ الكسري لكل من ES و EP


يمكننا الآن اشتقاق معادلة معدل التفاعل الصافي إلى الأمام لحالة التوازن السريع:

مع العلم أن k2ه0 و ك-2ه0 تمثل السرعات القصوى ، VF و V.صعلى التوالي ، تصبح المعادلة:

يمكن اشتقاق معادلة من نفس الشكل من افتراض الحالة المستقرة. تختلف هذه المعادلة بوضوح عن المعادلة السابقة (4) المشتقة من خلال افتراض حدسي لطرح بسيط للمعدلات الأمامية والعكسية التي لا رجعة فيها والتي أظهرنا الآن أنها غير صالحة عن طريق المقارنة.

تحتوي برامج مثل COPASI على العديد من المعادلات المضمنة لسرعات العديد من التفاعلات المحفزة بالإنزيم والتي لها أشكال مماثلة. اثنان موضحة أدناه:

عكوس ميكايليس مينتين:

التثبيط التنافسي القابل للانعكاس:


تحليل التحكم الأيضي - مثال مقال

تحليل التحكم الأيضي الغرض من تحليل التحكم الأيضي وكيفية ارتباطه بحركية الإنزيم تحليل التحكم الأيضي هو نموذج يُستخدم لفحص توزيع التدفقات والتركيزات الأيضية الأخرى في المسارات الأيضية بين الإنزيمات المختلفة الموجودة داخل المسار (Heinstra وجير ، 1991). يفترض هذا النموذج أن هناك مقياسًا معينًا للتحكم في التدفق موزع داخل الإنزيمات. إنه مفيد لأنه يشرح كيف تعتمد كمية التدفقات والتركيزات الوسيطة على بعض اعتبارات الشبكة الخاصة.

يساعد النموذج في فهم التحكم الذي يمارسه كل إنزيم على التدفقات والتركيزات (Acerenza & Kacser ، 1997). يعد تحليل التحكم الأيضي إحدى طرق دراسة السلوك الحركي للأنظمة الأنزيمية. حركية الإنزيم هي دراسة الطريقة التي تحفز بها الإنزيمات التفاعلات الكيميائية. يساعد إجراء تحليل التحكم الأيضي على فهم تأثيرات الخصائص التي تمتلكها إنزيمات معينة ، وكيف تؤثر على التدفقات والتركيزات الأيضية. باستخدام هذا النموذج ، من الممكن معرفة كيف تؤثر التغييرات في التركيز الأنزيمي على حساسية المتغيرات الأيضية مثل التدفقات والتركيزات الأيضية.

لذلك ، يساعد تحليل التحكم الأيضي في حساب هذه الحساسيات ، والمعروفة باسم معاملات التحكم في التدفق للأنزيمات من مرونتها ، أو الخواص الحركية. تم تعديل الإجراءات المستخدمة في الحسابات لتلائم أكثر تصاميم المسارات تعقيدًا. ومن ثم ، فقد تم اشتقاق الإجراءات الرياضية لتمكين حساب تأثيرات معاملات التحكم في التدفق وفقًا لشدتها. كل هذه المعلومات ضرورية لفهم كيفية عمل شبكات الإنزيم.

لذلك ، يصبح من الممكن التنبؤ برد فعلهم لأي اضطراب خارج عن القاعدة ، مثل الاضطرابات البيئية (Heinstra & Geer ، 1991). طرق مختلفة يمكن للمرء من خلالها تقدير معاملات التحكم في التدفق تحدد معاملات التحكم التغير النسبي في التدفقات والتركيزات ، والذي يحدث كاستجابة للتغيرات البيئية والوراثية على الإنزيمات. هناك طرق مختلفة لتقدير هذه المعاملات. إحدى الطرق هي التعديل الفردي ، وهو طريقة بسيطة ، تُستخدم في الحالات التي يتعطل فيها إنزيم واحد فقط.

طريقة أخرى هي التعديل المزدوج. في هذه الطريقة ، يتم استخدام خطوتين في دراسة المسار وبدون معرفة الخصائص الحركية مقدمًا ، ومن ثم تُعرف الخصائص الحركية بعد إجراء التحليل. هذه الطريقة مفيدة لأن قيم التغييرات لا يجب أن تكون معروفة مسبقًا. وفقًا لتحليل Acerenza و Cornish-Bowden (1990) ، تجعل هذه الخاصية الطريقة مرنة بحيث يمكن استخدامها على هياكل مختلفة بأحجام مختلفة.

المراجع Acerenza، L. & Cornish-Bowden، A. (1997). تعميم طريقة التعديل المزدوج لتحديد المرونة في الموقع. بيوكيم ، مجلة ، 327 ، 217-223. Acerenza ، L. & Kacser ، H. (1990). حركية الإنزيم والتحكم في التمثيل الغذائي. طريقة لاختبار وقياس تأثير الخصائص الأنزيمية على المتغيرات الأيضية. مجلة الكيمياء الحيوية ، 269 (3) ، 697-707 .Heinstra ، P.H & Geer ، B.W (1991). تحليل التحكم الأيضي وتنوع الإنزيم: التلاعب الغذائي بالتدفق من الإيثانول إلى الدهون في ذبابة الفاكهة. مول. بيول. Evol.، 8 (5) ، 703-708.


محتويات

معامل التحكم [7] [8] [9] يقيس تغير الحالة الثابتة النسبي في متغير النظام ، على سبيل المثال تدفق المسار (J) أو تركيز المستقلب (S) ، استجابة لتغير نسبي في معلمة ، على سبيل المثال نشاط الإنزيم أو معدل الحالة المستقرة (v i >) من الخطوة الأولى. معاملا التحكم الرئيسيان هما معاملات التحكم في التدفق والتركيز. يتم تحديد معاملات التحكم في التدفق بواسطة

ومعاملات التحكم في التركيز بواسطة

نظريات الجمع تحرير

تم اكتشاف نظرية تجميع التحكم في التدفق بشكل مستقل من قبل مجموعة Kacser / Burns ومجموعة Heinrich / Rapoport في أوائل السبعينيات وأواخر الستينيات. تشير نظرية تجميع التحكم في التدفق إلى أن التدفقات الأيضية هي خصائص نظامية وأن التحكم فيها مشترك من قبل جميع التفاعلات في النظام. عندما يغير تفاعل واحد سيطرته على التدفق ، يتم تعويض ذلك عن طريق التغييرات في التحكم في نفس التدفق بواسطة جميع التفاعلات الأخرى.

يقيس معامل المرونة الاستجابة المحلية لإنزيم أو تفاعل كيميائي آخر للتغيرات في بيئته. تتضمن هذه التغييرات عوامل مثل الركائز أو المنتجات أو تركيزات المستجيب. لمزيد من المعلومات ، يرجى الرجوع إلى الصفحة المخصصة لمعاملات المرونة.

تحرير نظريات الاتصال

نظريات التوصيل هي علاقات محددة بين معاملات المرونة والتحكم. إنها مفيدة لأنها تسلط الضوء على العلاقة الوثيقة بين الخصائص الحركية للتفاعلات الفردية وخصائص النظام للمسار. توجد مجموعتان أساسيتان من النظريات ، واحدة للتدفق والأخرى للتركيزات. يتم تقسيم نظريات اتصال التركيز مرة أخرى اعتمادًا على ما إذا كانت أنواع النظام S n < displaystyle S_> يختلف عن الأنواع المحلية S m < displaystyle S_> .

من الممكن دمج الجمع مع نظريات التوصيل للحصول على تعبيرات مغلقة تربط معاملات التحكم بمعاملات المرونة. على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك أبسط مسار غير تافه:

باستخدام هاتين المعادلتين ، يمكننا حل معاملات التحكم في التدفق

باستخدام هذه المعادلات ، يمكننا إلقاء نظرة على بعض السلوكيات المتطرفة البسيطة. على سبيل المثال ، لنفترض أن الخطوة الأولى غير حساسة تمامًا لمنتجها (أي عدم التفاعل معها) ، S ، ثم ε S v 1 = 0 < displaystyle varepsilon _^> = 0>. في هذه الحالة ، تنخفض معاملات التحكم إلى

هذا هو كل عنصر التحكم (أو الحساسية) في الخطوة الأولى. يمثل هذا الموقف خطوة تحديد المعدل الكلاسيكية التي يتم ذكرها بشكل متكرر في الكتب المدرسية. يعتمد التدفق عبر المسار تمامًا على الخطوة الأولى. في ظل هذه الظروف ، لا يمكن لأي خطوة أخرى في المسار أن تؤثر على التدفق. ومع ذلك ، فإن التأثير يعتمد على الحساسية الكاملة للخطوة الأولى لمنتجها. من المحتمل أن يكون مثل هذا الموقف نادرًا في المسارات الحقيقية. في الواقع ، لم تتم ملاحظة خطوة الحد من المعدل الكلاسيكية تقريبًا من الناحية التجريبية. بدلاً من ذلك ، يتم ملاحظة مجموعة من القيود ، مع وجود بعض الخطوات التي لها قيود (تحكم) أكثر من غيرها.

يمكننا أيضًا اشتقاق معاملات التحكم في التركيز للمسار البسيط المكون من خطوتين:

ضع في اعتبارك المسار البسيط المكون من ثلاث خطوات:

حيث D يتم إعطاء المقام بواسطة

لاحظ أن كل حد في البسط يظهر في المقام ، وهذا يضمن استيفاء نظرية تجميع معامل التحكم في التدفق.

وبالمثل ، يمكن أيضًا اشتقاق معاملات التحكم في التركيز ، لـ S 1 < displaystyle S_ <1>>

لاحظ أن المقامات تظل كما كانت من قبل وتتصرف كعامل تطبيع.

يمكننا أن نتقدم خطوة أخرى ونقيس المشتقات لاختزال الوحدات. يؤدي ضرب كلا الجانبين في e 1 < displaystyle e_ <1>> وقسمة كلا الجانبين على x < displaystyle x> إلى الحصول على المشتقات المقاسة:


نتائج

تأثير إجهاد LK على نمو نبات الشعير البري التبتي والشعير المزروع

أظهرت ثلاثة أنماط وراثية من الشعير المستخدمة في هذه التجربة اختلافًا واضحًا في تحمل LK من حيث الكتلة الحيوية بعد التعرض لإجهاد LK لمدة 16 يومًا (الشكل 1 أ و ب). كان انخفاض الوزن الطازج للجذور (RFW) والوزن الطازج (SFW) الناجم عن LK مقارنةً بمجموعة التحكم حوالي 8٪ و 25٪ ، على التوالي ، بمتوسط ​​أكثر من ثلاثة أنماط وراثية (الشكل 1 أ و ب). اختلف المدى المنخفض بين ثلاثة أنماط وراثية ، حيث أظهر XZ141 انخفاضًا كبيرًا في RFW ولم يكن تقليل نمطين وراثيين آخرين مهمًا (الشكل 1 أ). على الرغم من أن SFW انخفض بشكل كبير بالنسبة لجميع الأنماط الجينية الثلاثة في النباتات المعالجة بـ LK ، إلا أن XZ153 أظهر انخفاضًا أقل بشكل واضح من نمطين وراثيين آخرين (الشكل 1 ب). وبالمثل ، تم تقليل قيم SPAD (محتوى الكلوروفيل) لجميع الأنماط الجينية الثلاثة بشكل كبير تحت إجهاد LK ، مع انخفاض XZ153 (حوالي 22٪) و XZ141 (حوالي 33٪) ، على التوالي (الشكل 1 ج).علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة الأعراض الواضحة لنقص K في الأوراق القديمة لـ XZ141 ، بينما أظهر LuDaoMai و XZ153 الأعراض المعتدلة والخفيفة على التوالي (الشكل 1 د). باختصار ، أكدت النتائج الحالية النتائج السابقة التي تفيد بأن XZ153 كان أكثر تحملاً للـ LK من XZ141 و LuDaoMai.

أداء النمو للأنماط الجينية الثلاثة للشعير تحت السيطرة (C) وظروف انخفاض البوتاسيوم (LK). أ الوزن الطازج للجذر (ن = 4) (ب) أطلق النار على وزن جديد (ن = 4) (ج) قيمة سباد (محتوى الكلوروفيل) (ن = 6) (د) أعراض LK من الأوراق القديمة. * و ** تشير إلى أهمية (ص & lt 0.05) وذات دلالة عالية (ص & lt 0.01) الفروق بين معاملة التحكم على التوالي

التغييرات في ملامح المستقلب لثلاثة أنماط جينية استجابة لإجهاد LK

تم اكتشاف 57 نوعًا من المستقلبات تمامًا ، والتي تغيرت بشكل كبير تحت ضغط LK بالنسبة للتحكم (C) في كل من جذور وأوراق ثلاثة أنماط وراثية (ملف إضافي 1: الجدول S1). من أجل تحديد المستقلبات المختلفة بين الشعير التبتي البري والمزروع استجابة لتغذية K ، تم إجراء جميع ملفات تعريف المستقلب ، التي تتكون من 72 عينة من الشعير (أي تتكون من نسجين وثلاثة أنماط وراثية ومستويين K وستة مكررات) ، بواسطة Heatmap والتحليل الهرمي العنقودي. وفقًا لتحليل Heatmap (الشكل 2) ، يمكن ملاحظة فصل واضح بين أنسجة نباتية ضمن مجموعة التحكم أو معالجة LK ، حيث تم تجميع 72 عينة بوضوح في فئتين ، كل 36 عينة للجذر والأوراق ، على التوالي. علاوة على ذلك ، يمكن تقسيم فئتين فرعيتين ، تتكونان من عينات من معاملة التحكم و LK على التوالي ، داخل عينات الأوراق والجذور (الشكل 2).

خريطة الحرارة وتحليل الكتلة الهرمية لـ 57 مستقلبًا تم اكتشافه في الأنماط الجينية للشعير الثلاثة. C: التحكم LK: انخفاض البوتاسيوم R: الجذر L: الورقة. تم سرد أسماء المستقلبات الموضحة في الأرقام المقابلة من 1 إلى 57 في ملف إضافي 1 الجدول S1

ملامح ومسار المستقلب في جذور الشعير استجابة لإجهاد LK

تم تغيير 55 مستقلبًا في الجذور بشكل كبير في تركيزاتها تحت إجهاد LK مقارنةً بالتحكم ، بما في ذلك 18 من الأحماض الأمينية و 14 سكريات وبوليولات و 16 حمضًا عضويًا و 7 مركبات أخرى (الجدول 1). من أجل الكشف عن تأثير إجهاد LK على تناوب المستقلب ، تم إجراء تحليل PCA على تلك المستقلبات البالغ عددها 55 (الشكل 3 والملف الإضافي 2: الجدول S2). من الواضح أنه يمكن فصل عينات كل من التحكم ومعالجة LK بوضوح بواسطة PC1 ، وهو ما يمثل حوالي 55.9٪ من التباين الكلي (الشكل 3 أ). تشمل المستقلبات الرئيسية المساهمة في PC1 الإينوزيتول والبوتريسين وحمض الماليك و L- الجلوتامين والجلوكوز ومستقلبات أخرى 10 (الشكل 3 أ). يمكن أن يفصل PC2 بوضوح العينات المعالجة بـ LK ضمن ثلاثة أنماط وراثية ولكنه لم يفصل بين عينات التحكم (الشكل 3 أ). وهكذا ، تم إجراء مزيد من التحليل الجزئي للتمييز بين المربعات الصغرى (PLS-DA) لتحديد الفرق (الشكل 3 ب والملف الإضافي 3: الجدول S3). في ظل حالة التحكم ، كانت المستقلبات في الجذور المساهمة في المكون 1 (تمثل حوالي 41.4٪) هي L-glutamine و L-lysine وحمض succinic والسكروز وحمض fumaric و 10 مستقلبات أخرى (الشكل 3 ب وملف إضافي 3: الجدول S3).

تحليل تباين استقلاب الجذر وأعلى 15 مستقلبًا لكل من PC1 و Comp 1. أ تحليل المكون الرئيسي (PCA) لاختلاف التمثيل الغذائي للجذر بين العينات وأفضل 15 مستقلبًا يساهم في PC1 (ب) تحليل تمييز المربعات الصغرى الجزئية (PLS-DA) لاختلاف التمثيل الغذائي للجذر بين العينات. PC1: المكون الرئيسي الأول PC2: المكون الرئيسي الثاني Comp1: المكون 1 C: التحكم LK: انخفاض البوتاسيوم R: الجذر (ن = 6)

تحت إجهاد LK ، أظهر 38 و 11 مستقلبات في جذور XZ153 و 30 و 16 مستقلبات في جذور XZ141 و 40 و 10 مستقلبات في جذور LuDaoMai زيادة كبيرة وتراكمًا لأسفل على التوالي (الجدول 1). بشكل عام ، تسبب إجهاد LK في زيادة كبيرة في العديد من الأحماض الأمينية الأساسية أو المحايدة (الشكل 4 والجدول 1). تراكمت محتويات XZ153 أعلى من L-phenylalanine (حوالي 1.5 ضعفًا) ، أورنيثين (حوالي 2.9 ضعفًا) ، L-lysine (حوالي 5.3 أضعاف) ، L-asparagine (حوالي 1.8 ضعفًا) وأحماض L-glutamine (حوالي 11.7 ضعفًا) - أضعاف) من XZ141 و LuDaoMai (الجدول 1). بينما انخفضت الأحماض الأمينية الحمضية ، مثل حمض الأسبارتيك والغلوتامات ، في جميع الأنماط الجينية الثلاثة تحت إجهاد LK ، حيث أظهر XZ141 أكبر انخفاض (الجدول 1). يؤدي تثبيط تخليق حمض الأسبارتيك إلى تقليل-ألانين المصب (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أنه تم تقليل L-alanine و tyrosine في XZ141 ، ولكن ليس في النوعين الآخرين (الجدول 1).

المسارات الأيضية في جذور الأنماط الجينية الثلاثة للشعير استجابةً للإجهاد المنخفض K. تمثل الأعمدة الستة من اليسار إلى اليمين على المحور X LuDaoMai (التحكم والمعالجة) و XZ141 (التحكم والمعالجة) و XZ153 (التحكم والمعالجة) ، على التوالي. يتم تقديم تركيز كل مستقلب على المحور Y بعد تطبيعه على برنامج Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)

تم تعزيز تراكم معظم السكريات ومستقلباتها ذات الصلة تحت إجهاد LK (الشكل 4 والجدول 1). كما تم زيادة محتويات المستقلبات النهائية ، مثل الفركتوز والجلوكوز والمانيتول والتريهالوز ، مع زيادة محتوى السكروز. علاوة على ذلك ، كانت المستويات النسبية للكربوهيدرات ، مثل الزيلوز والأرابينوز والجلوكوز والسكروز والجالاكتوز والبوليولات أعلى في XZ153 عنها في XZ141 (الشكل 4 والجدول 1). يحتوي XZ153 على أعلى محتويات ريبوز وتريهالوز بين ثلاثة طرز وراثية تحت ضغط LK ، حيث زاد بنحو 3.2 و 2.9 أضعاف ، على التوالي مقارنةً بمجموعة التحكم (الجدول 1).

في المقابل ، تسبب إجهاد LK في انخفاض كبير في المستقلبات المشاركة في دورة TCA ، كما يتضح من انخفاض محتوى حمض السكسينيك والسترات وحمض الماليك وحمض الكيتوجلوتاريك (الشكل 4 والجدول 1) ، مما يشير إلى أن إنتاج الطاقة من خلال دورة TCA تحت ضغط LK. ومن المثير للاهتمام أنه كان هناك اختلاف كبير في النمط الجيني في المحتوى النسبي للسيترات وحمض الكيتوجلوتاريك وحمض الماليك تحت ضغط LK ، حيث أظهر XZ141 انخفاضًا أكبر من الأنماط الجينية الأخرى (الشكل 4 والجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، زادت محتويات بعض الأحماض العضوية ، مثل حمض البنزويك وحمض الماليك وحمض الأسكوربيك تحت إجهاد LK ، بينما انخفض حمض الكينيك في XZ141 (الشكل 4 والجدول 1). علاوة على ذلك ، تم اكتشاف الاختلاف الوراثي أيضًا في المستقلبات الأخرى ، بما في ذلك أحماض اليوريا واليوراسيل والبيبيريدين (الجدول 1).

ملامح المستقلبات والمسار في أوراق الشعير استجابة لإجهاد LK

تم أيضًا تغيير مستقلبات الأوراق لثلاثة أنماط وراثية بشكل كبير تحت إجهاد LK مقارنةً بمجموعة التحكم (الجدول 2). تم تغيير 52 مستقلبًا بشكل كبير في تركيزاتها تحت ضغط LK مقارنةً بالتحكم (الجدول 2). أظهرت نتائج PCA أن PC1 يمكن أن يفصل بين عينات التحكم ومعالجة LK ، وهو ما يمثل حوالي 56.2 ٪ من التباين (الشكل 5 والملف الإضافي 4: الجدول S4). على عكس الجذور ، يمكن أن يفصل PC2 بوضوح عينات الأوراق داخل الأنماط الجينية ، موضحًا ما يقرب من 17.5 ٪ من التباين (الشكل 5). كانت المستقلبات الخمسة عشر الرئيسية المساهمة في PC1 في الأوراق هي 5 سكريات (الجلوكوز والفركتوز والأرابينوز والسوربوز والجالاكتوز) و 3 أحماض أمينية (فالين وتيروزين وليوسين) ، و 7 نواتج أيضية أخرى ، بينما سيطر حمض الفوماريك على PC2 ، بيتا ألانين ، مالتوز ، L- ألانين و L- برولين (الشكل 5 وملف إضافي 4: الجدول S4).

تحليل تباين مستقلب الأوراق وأهم 15 مستقلبًا تساهم في PC1 و PC2. PC1: المكون الرئيسي الأول PC2: المكون الرئيسي الثاني C: التحكم LK: انخفاض البوتاسيوم L: الورقة (ن = 6)

مثل التغييرات في مستقلبات الجذر ، تم أيضًا تحسين مستويات أكثر من ثلثي الأحماض الأمينية في أوراق النباتات تحت إجهاد LK (الجدول 2). من بينها L-serine (حوالي 2.0 ضعفًا) ، L-phenylalanine (3.7 أضعاف) ، L-lysine (5.3 أضعاف) ، التيروزين (4.9 أضعاف) ، L-asparagine (43.1 ضعفًا) وحمض الجلوتاميك ( 13.8 ضعفًا) زادت في XZ153 أكثر من XZ141 و LuDaoMai (الجدول 2). ومع ذلك ، تم تقليل حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك في جميع الأنماط الجينية الثلاثة ، حيث كان XZ141 أكثر تأثراً (الشكل 6 والجدول 2).

المسارات الأيضية في أوراق الأنماط الجينية الثلاثة للشعير استجابةً للإجهاد المنخفض K. تمثل الأعمدة الستة من اليسار إلى اليمين على المحور X LuDaoMai (التحكم والمعالجة) و XZ141 (التحكم والمعالجة) و XZ153 (التحكم والمعالجة) ، على التوالي. يتم تقديم تركيز كل مستقلب على المحور Y بعد تطبيعه على برنامج Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)

زاد الإجهاد LK من محتويات بعض السكريات الذائبة (مثل الجلوكوز والفركتوز والسكروز) مقارنةً بالتحكم (الشكل 6 والجدول 2). ومن ثم ، أظهر XZ153 زيادة كبيرة في محتويات الجلوكوز (حوالي 24.8 ضعفًا) ، والجالاكتوز (13.5 ضعفًا) والأرابينوز (3.6 أضعاف) تحت إجهاد LK ، وهو زيادة أكبر بكثير من الأنماط الجينية الأخرى. من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن تأثير إجهاد LK على محتوى السكروز يختلف اختلافًا كبيرًا بين أنسجة النبات وبين الأنماط الجينية. كان لدى XZ153 و LuDaoMai تغير طفيف في الأوراق تحت إجهاد LK ، بينما أظهر زيادة كبيرة في الجذور (الشكل 6 والجدول 2). في المقابل ، أظهر XZ141 زيادة كبيرة في الأوراق تحت إجهاد LK ، بينما تغير طفيف في الجذور (الجدول 2).

بالإضافة إلى ذلك ، تم تثبيط دورة TCA بشكل كبير تحت إجهاد LK ، كما هو موضح في المحتوى المنخفض لحمض الستريك وحمض الكيتوجلوتاريك والسكسينيك بالإضافة إلى وسيطة TCA الأخرى مقارنةً بالتحكم (الشكل 6 والجدول 2). على سبيل المثال ، انخفضت محتويات حمض الكيتوجلوتاريك وحمض الماليك بشكل كبير في XZ141 ، حيث كانت أقل بكثير من النوعين الجينيين الآخرين. علاوة على ذلك ، تم تسجيل انخفاض تراكم حمض الأسكوربيك وحمض البيروجلوتاميك تحت إجهاد LK في XZ141 ، ولكن ليس في النوعين الآخرين (الجدول 2).


نتائج

منحنيات معايرة اللاكتات

تتمثل إحدى السمات الأكثر صلة بنهج MCA في إمكانية وصف استجابة النظام وتوزيع التحكم على طول المسار الأيضي بطريقة كمية. في الحالة قيد الدراسة ، يعتبر التحديد الكمي الدقيق لاكتات المنتج النهائي مسألة مهمة لتحديد التدفق الحال للجلوكوز بشكل صحيح (الشكل 2 أ).

لتحديد كمية اللاكتات ، من الأهمية بمكان معايرة المقايسة من خلال مراعاة منحنى مرجعي مع كتل اللاكتات المعروفة. يوضح الشكل 2 ب مخططًا للتفاعلات المزدوجة التي تتيح للطالب بسهولة إجراء قياسات اللاكتات. من ناحية أخرى ، يوضح الشكل 2 د لقطة من ممثل لوحة 96 بئر للنتائج التي يتم الحصول عليها عادةً عند اكتمال التفاعل اللوني. يتم الحصول على منحنى المعايرة (يتم تشغيله بواسطة نسختين) بشكل مستقل من قبل مجموعات مختلفة من الطلاب: يتم رسم قيم الامتصاصية كدالة لكتلة اللاكتات (الشكل 3 أ والجدول 1). من الجدير بالذكر أن الخطية لوحظ حتى 40 نانومول من اللاكتات ، وهو حد أعلى مفيد للقياسات اللاحقة.

المنحدر (Abs × nmol −1)
مجموعة واحدة من الطلاب (2017) 0.0217 ±0.0009 0.0216 ±0.0009
مجموعة 2016 0.0178 ± 0.0001
مجموعة 2017 0.0208 ± 0.0003
  • تم استخدام حلول لتركيزات مختلفة من اللاكتات لبناء منحنى معايرة باستخدام الكواشف من مجموعة أدوات Roche Diagnostics (إنديانابوليس ، إنديانا) وصور فوتوغرافية للوحات 96 بئر (المعلومات الداعمة الشكل S3). كمثال ، يوضح هذا الجدول منحدرات منحنيات المعايرة التي حصلت عليها مجموعة واحدة من 20 طالبًا (2017) للوحة واحدة تم قياسها من نسختين. وبالمثل ، يتم عرض متوسطات المنحدرات التي تم قياسها من قبل جميع مجموعات الطلاب الذين أكملوا الدورة في عام 2016 (الفوج 2016) أو في عام 2017. يشار أيضًا إلى الانحرافات المعيارية لكل نتيجة.

اختبرنا أيضًا أداء اكتشاف اللاكتات بعد تخفيف الكواشف حتى 10 مرات ، مع ملاحظة أن الفحص يظل فعالاً ، لكن النطاق الخطي يصبح أقصر عند التخفيفات الأعلى. لذلك ، لتقليل التكاليف دون المساس بالأداء ، قررنا تخفيف الكواشف إلى النصف فقط. يمثل هذا التخفيف اختيارًا جيدًا ، لأنه يضمن استجابة خطية موحدة في القناة الخضراء. يوضح الشكل 3 ب والجدول 1 النتائج التي حصلت عليها مجموعات الطلاب على مدار فترتين متتاليتين من الفصول (2016 و 2017). لوحظ قابلية استنساخ عالية من خلال مقارنة نتائج هذين الفوجين.

قياسات الجليكوليتيك الجريان وتثبيطه بواسطة IAA

كما هو موضح أعلاه ، نقيس تدفق حال السكر في وجود تركيزات مختلفة من IAA عن طريق تحديد كمية اللاكتات خارج الخلية التي تفرزها كرات الدم الحمراء كدالة لوقت الحضانة (الشكل 4). ). ينتج عن تخزين كرات الدم الحمراء تحت ظروف بنك الدم تغييرات كيميائية حيوية كبيرة 15 ، خاصة بعد الأسبوعين الأولين من التخزين 32. يمكن ملاحظة الفروق الكمية في خصائص تدفق حال السكر وتنظيم هذا المسار الأيضي ، اعتمادًا على الشيخوخة في المختبر من الخلايا ، وبالتالي يصبح من الأهمية بمكان العمل مع كرات الدم الحمراء المرسومة حديثًا.

يتم عرض النتائج من تجربة نموذجية تم إجراؤها في نسختين من قبل مجموعة واحدة من الطلاب في اللوحات A و B من الشكل 4. لتقدير قيم التدفق ، يعالج الطلاب البيانات عن طريق الانحدار الخطي في كل سلسلة زمنية تقابل تركيزًا معينًا للمثبط المقاس. . تظهر النتائج كمخطط مدمج بما في ذلك جميع البيانات المتاحة. كما هو متوقع ، في حالة عدم وجود IAA ، تُظهر كمية اللاكتات في المادة الطافية أكبر زيادة مع مرور الوقت ، مما يدل على أن كرات الدم الحمراء تظل نشطة أيضيًا في ظل هذه الظروف التجريبية: حضانة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت لـ RBC ، و 20 ملي مولار من الجلوكوز. الأهم من ذلك ، لم يلاحظ أي انحلال دم كبير خلال فترة الحضانة هذه ، وقيم تركيز اللاكتات في بداية التجربة متشابهة جدًا لجميع الحالات التي تمت تجربتها ، ولا يعاني التفاعل اللوني لمقايسة اللاكتات من تداخل المثبط حتى أعلى تركيز تم فحصه . الأهم من ذلك ، أن الإنتاج الخطي للاكتات الذي تمت ملاحظته كدالة زمنية يتوافق مع الشرط الرئيسي الضروري لتطبيق هذا النوع من التحليل ، أي أن النظام يجب أن يتوافق مع الحالة المستقرة.

من ناحية أخرى ، فإن وجود مثبط IAA يقلل من إنتاج اللاكتات ، خاصة عندما تتعرض الخلايا لتركيز IAA أعلى من 1 ملي مولار. في الواقع ، يؤدي التعرض لـ 5 ملي مولار من IAA إلى إلغاء كامل لإنتاج اللاكتات. بحلول هذا الوقت من النشاط ، يدرك الطلاب أن IAA يسبب اضطرابًا كبيرًا في المسار الأيضي الذي ينطوي عليه توليد اللاكتات: تحلل السكر المقترن بتخمير اللاكتات.

لافت للنظر، كل تركيز مثبط يحدد حالة مستقرة مختلفة، التي تتميز بتدفق اللاكتات الخاص. من خلال الفحص البسيط ، يمكن للطلاب مقارنة التدفقات المقاسة بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حساب الخطأ القياسي المرتبط بتوافق الانحدار الخطي يسمح للشخص بتقييم دقة قياسات تدفق اللاكتات. تشير خبرتنا المجمعة إلى المتانة الكلية لمجموعة البيانات الناتجة.

نتائج الجريان (JIAA) يتم رسم البيانات كدالة لتركيز IAA الذي تم الحصول عليه من قبل مجموعتين مستقلتين من طلاب مجموعة 2017 في الشكل 5 أ والجدول 2. إن ملف تعريف تباين التدفق مع التركيز المتزايد IAA قابل للتكرار للغاية. البيانات المتراكمة التي حصلت عليها جميع مجموعات الطلاب خلال عامي 2016 و 2017 مخططة معًا (الشكل 5 ب والجدول 2). تنشأ بعض النقاط المثيرة للمناقشة من ملاحظة شكل الرسم البياني. أولاً ، يمكن تحديد مناطق مختلفة بوضوح في JIAA مقابل منحنيات [IAA]. في الواقع ، طفيف زيادة في التدفق (أكثر وضوحا في مجموعة بيانات 2017) يمكن ملاحظتها عند انخفاض تركيز IAA. من ناحية أخرى ، بتركيزات أعلى من 0.5 ملي مولار ، يؤدي IAA إلى تثبيط واضح لتدفق المسار. يتناقص التدفق فجأة عند تركيزات IAA بين 1 و 2 ملي مولار ، لتصل إلى قيم فارغة تقريبًا عند حوالي 5 ملي مولار.

IAA تدفق حال السكر
(مم) (ميكرومتر دقيقة -1)
مجموعة واحدة من الطلاب (2017) مجموعة 2016 2017 cohor
0.00 14.0 ± 1.2 أ 11.7 ± 1.4 ب 10.6 ± 3.0 13.6 ± 2.3
0.05 11.7 ± 0.8 13.5 ± 1.3 10.4 ± 3.4 14.1 ± 1.6
0.10 13.9 ± 1.4 14.5 ± 1.2 10.4 ± 2.7 14.5 ± 1.5
0.50 15.1 ± 0.7 14.4 ± 1.5 8.8 ± 3.3 13.6 ± 1.3
0.75 14.0 ± 2.1 12.2 ± 3.2 5.8 ± 1.9 13.6 ± 1.3
1.00 13.3 ± 1.9 10.6 ± 2.8 2.7 ± 1.1 12.2 ± 1.7
2.00 2.6 ± 0.7 1.8 ± 0.4 0.4 ± 0.6 2.7 ± 0.9
5.00 0.4 ± 0.7 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.4 0.4 ± 1.4
  • تم قياس تدفقات حال السكر عند قياس إنتاج اللاكتات من منحدرات الخطوط المستقيمة الموضحة في الشكل 2. يوضح هذا الجدول تلك التدفقات المحسوبة من قبل مجموعة واحدة من 20 طالبًا لصفيحة واحدة ، و b لنسختها. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض متوسطات التدفقات المحسوبة لكل تركيز IAA من قبل جميع مجموعات الطلاب الذين أكملوا الدورة في 2016 أو 2017. يشار أيضًا إلى الانحرافات المعيارية لكل نتيجة.

استجابة النظام لمثبط GAPDH IAA

تم إجراء مزيد من التحليل لمعالجة مسألة حساسية التدفق لوجود مثبطات. يوضح الشكل 6 تركيب المعادل. 6 إلى بيانات تدفق حال السكر وسلوك استجابة التدفق المحسوب لتركيز IAA (R IAA J). يسمح هذا التمرين في الانحدار غير الخطي للفرد باستعادة ، بطريقة بسيطة ، وظيفة المشتق ∂ J ss ∂ IAA [Eq. 7] ومعامل الاستجابة R IAA J [Eq. 8]. بعد الملاءمة الأولية ، يمكن حساب الأخير بشكل أكثر وضوحًا باستخدام المعادل. 9.

هنا مرة أخرى ، يمكن ملاحظة ثلاث مناطق مختلفة في منحنى R IAA J. الأول (في نطاق تركيزات IAA بين 0 و 1 ملي مولار) يتميز بقيم موجبة قليلاً لمعامل الاستجابة. في المنطقة الثانية (المدى بين 1 و 2 ملي مولار) ، لوحظت قيم سلبية عالية للمعامل ، مما يشير إلى أن التدفق الحال للجلوكوز يصبح شديد الحساسية للتغير في تركيز المثبط. تسلط هذه المنطقة الضوء على حقيقة أن التغييرات الطفيفة في تركيز المثبط يمكن أن تؤدي إلى تغيير كبير في تدفق حال السكر. بعبارة أخرى ، في ظل هذه الحالة الأيضية ، على سبيل المثال ، تدفقات الحالة المستقرة المقاسة عند 1.5 ملي مولار IAA ، يُظهر التدفق الحال للجليك حساسية عالية للتثبيط ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى تغيير طفيف في نشاط GAPDH. المنطقة الثالثة (تركيزات IAA أعلى من 2.2 ملي مولار) تهيمن عليها تدفقات تحلل السكر منخفضة للغاية ، ومعاملات الاستجابة تقترب من الصفر عند تركيزات IAA أعلى من 3 ملي مولار.

قد يُعزى التباين الملحوظ في تدفق حال السكر بشكل أساسي إلى تأثير المثبط الذي يستهدف نشاط GAPDH. ومع ذلك ، في الخلية ، تم الإبلاغ عن أن IAA يتفاعل مع الشكل المخفض من الجلوتاثيون (GSH) أيضًا ، وبالتالي يؤثر على إمكانات الأكسدة والاختزال في الحيز السيتوبلازمي ويؤثر على استقلاب GSH. في هذا السياق المعقد ، لا يمكن اعتبار IAA مثبطًا محددًا للإنزيم ، مما يحول دون حساب معامل التحكم في التدفق لـ GAPDH C GAPDH J على مسار التحلل الجلدي بمجرد الأخذ في الاعتبار معامل تدفق الاستجابة R IAA J وقيمة مرونة GAPDH بواسطة IAA ε IAA GAPDH ، كما في Eq. 5.

ردود مختلفة لمثبطات IA و IAA

نقوم أيضًا بتحليل تأثير IA كمثبط محتمل لمسار تخمير تحلل السكر واللاكتات (الشكل 7).تم الإبلاغ عن أن IA يتصرف كمثبط أكثر فعالية لـ GAPDH لأنه يتفاعل بشكل أفضل مع هذا الإنزيم من IAA 29. في الشكل 7 , يتم رسم تدفق حال السكر كدالة لتركيزات IAA أو IAA جنبًا إلى جنب للمقارنة. اللافت للنظر ، لوحظ التأثير الأقصى لـ IA عند تركيز مثبط منخفض جدًا (حوالي 0.1 ملي مولار) ، أقل بكثير من ذلك حيث يظهر IAA تأثيره الأعلى (2.2 ملم: أكثر من 20 مرة أعلى من السابق). على الرغم من التشابه فيما يتعلق بالتفاعل الكيميائي ، فإن الاستجابة لكل مثبط مختلفة تمامًا. تتفق هذه النتائج بشكل جيد مع تلك التي لوحظت في أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا النجمية ، والتي أظهرت التأثير التفاضلي لهذه المثبطات على نظام الأكسدة والاختزال القائم على ثيول - ثاني كبريتيد الخلية 29. يمكن أن يؤثر IAA على استقلاب الجلوتاثيون الخلوي بشكل أكثر شدة من IA 29. لهذا السبب ، من المحتمل أن يكون التركيز الفعال لـ IA داخل كرات الدم الحمراء أعلى من ذلك الذي وصل إليه IAA لأن الأخير يتفاعل بدرجة أعلى من الأول مع مجموعة الثيول من الجلوتاثيون المختزل. من ناحية أخرى ، قد يختلف IA و IAA على مستوى تأثيرهما على نقل حمض اللاكتيك. يمكن للمرء أن يتكهن بأن تأثير IA المعزز قد يستفيد من اختيار آلية نقل الأنيون (MCT ، الشكل 2) ، مما يسهل دخوله إلى حجرة العصارة الخلوية و / أو تغيير التدفق الخارجي لحمض اللاكتيك. على الرغم من أننا لم نعثر على تقارير محددة حول هذه النقطة ، فقد تكون قضية مثيرة للاهتمام للمناقشة مع الطلاب في الفصل. ومن المثير للاهتمام ، بالنسبة لـ IAA ، أنه تم العثور على الحالة المستقرة مع أعلى معامل استجابة يصل إلى القيمة R IAA J

- 3.0 ، بينما بالنسبة لـ IA ، يأخذ المعامل قيمة R IA J

كما ذكر من قبل ، سيكون من المفيد الاستفادة من معامل الاستجابة لتقييم معامل التحكم في التدفق لـ GAPDH. ومع ذلك ، لإجراء هذا التحليل بأكثر الطرق وضوحًا ، من الضروري أن يكون سبب تعديل تدفق حال السكر بسبب مثبط محدد من الإنزيم [وبالتالي تمكين التطبيق الصحيح للمعادلات. 4 ، 5] ، لأنه في هذه الحالة فقط ، التغيير الناتج في التدفق سيحدث بالكامل عن طريق التغيير في نشاط إنزيم واحد (موصوف عدديًا بواسطة مرونة من هذا الإنزيم إلى المانع). فقط بهذه الطريقة Eq. يمكن تطبيق 4 لحساب معامل التحكم لهذا الإنزيم. في هذا الصدد ، سيكون من المثير للاهتمام للغاية دراسة سلوك المانع الدائم koningic acid (KA) ، وهو منتج طبيعي وجد أنه مثبط انتقائي لـ GAPDH 33-35. يمكن حساب معامل المرونة لـ GAPDH من كرات الدم الحمراء لـ KA بشكل تجريبي. في النهاية ، فإن استخدام المعادل. سيمكننا الشكل 4 من استنتاج ما إذا كان GAPDH يتصرف بالفعل باعتباره إنزيمًا يتحكم في التدفق من تحلل السكر والأهم من ذلك ، حيث يمارس الإنزيم هذا التحكم.

توقعات - وجهات نظر

في العقود الثلاثة الماضية تم توسيع MCA للتعامل بشكل أساسي مع جميع أنواع الهياكل الأيضية ، بما في ذلك تفاعلات الإنزيم والإنزيم والقنوات 36 والعمليات الفسيولوجية المعقدة مثل الإثارة-الانقباض وطاقة الميتوكوندريا في الخلايا العضلية 37. يجب على المعلمين تقييم مقدار تفاصيل النظرية التي يجب تضمينها في مستوى الكيمياء الحيوية الجامعية ، اعتمادًا على السياق الأكاديمي.

على الرغم من أن MCA لا يزال معروفًا قليلاً من قبل علماء التكنولوجيا الحيوية ، إلا أنه قد يوفر مفتاحًا لفهم سبب كون تأثير التلاعب الجيني على إنتاج المستقلبات التجارية مخيباً للآمال إلى حد ما 8 ، 41. في هذا الصدد ، يمكن للطلاب الاستفادة من النماذج الرياضية المنسقة لتحلل السكر بالخميرة بدرجات مختلفة من التعقيد ، والتي تحتوي على مجموعة كاملة من المعادلات التي تصف سرعات كل خطوة أيضية. يمكن بعد ذلك تحميل هذه النماذج في برامج النمذجة مثل COPASI 14 ، وذلك لمحاكاة التغييرات الديناميكية لمتغيرات النظام عند تغيير حجم معلمات النظام. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد الأهداف الرئيسية التي تسمح بزيادة إنتاج المنتجات ذات الصلة بالتكنولوجيا الحيوية ، مثل الإيثانول 11 أو الجلسرين 42 ، وتحليل مدى ملاءمة سلالات الخميرة المتاحة بالفعل. قد تكون أيضًا فرصة لمقارنة حساسية تحلل السكر في الخميرة ، على عكس تلك التي لوحظت في كرات الدم الحمراء.

قيود تطبيق منهج MCA

تم استخدام MCA بشكل شائع لوصف كيف تحدد التغيرات في أنشطة الإنزيم لمسار أيضي معين الشكل الذي تستجيب به المتغيرات الأيضية (التدفقات وتركيزات المستقلب). يتم تحديد ذلك من خلال معاملات الاستجابة والتحكم. ومع ذلك ، تم تطوير الإستراتيجية في الأصل للتنبؤ بالتأثير على متغيرات النظام تغييرات متناهية الصغر في الأنشطة [أ δالخامس أنا يؤدي إلى δي ss ، مكافئ. 1]. في بعض الحالات ، يرجع عدم القدرة على زيادة تدفق معين عن طريق تغيير نشاط إنزيم معين إلى انخفاض غير متوقع في معامل التحكم لهذا الإنزيم عند زيادة نشاطه. ومن اللافت للنظر أنه تم أيضًا تطوير مناهج أخرى ، والتي تأخذ في الاعتبار معاملات لـ تغييرات كبيرة. في الواقع ، تم العثور هنا على اختلافات كمية ونوعية في الاستجابة بالمقارنة مع متناهية الصغر العلاج 43 ، 44. يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار في هندسة المسارات الأيضية عندما تكون هناك حاجة لاستجابات أكبر ، على سبيل المثال ، في حالة تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.


الأهداف

لتعزيز الارتباط السهل بين الأنزيمات والتمثيل الغذائي

لبناء نموذج للمسار الأيضي من المعلمات الحركية للإنزيمات المعنية وبعض البيانات عن تركيزات الركائز والمُعدِلات

لإثبات وجود علاقة وثيقة بين السلوك المحلي لأي إنزيم والاستجابات الجهازية للمسارات الأيضية.

للحصول ، عن طريق المحاكاة ، على طريقة سهلة وسريعة وغير مكلفة للحصول على البيانات المطلوبة لتطبيق نظرية MCA

لاستخدام المفاهيم التي لا يستوعبها الطلاب بشكل واضح دائمًا

لتسهيل تعلم معاملات ونظريات MCA المختلفة


مناقشة

التمثيل الغذائي هو ظاهرة معقدة تنظم على مستويات متعددة. في السنوات الأخيرة ، ظهرت عائلة من عوامل النسخ التي يتم تنشيطها بواسطة الترابط والتي تسمى المستقبلات النووية كمنظمين رئيسيين لعمليات التمثيل الغذائي. يتم تنشيط المستقبلات النووية بواسطة المستقلبات مثل الأحماض الدهنية والجلوكوز ، وتتحكم في حلقات التغذية الراجعة السلبية 12،33 ، مما يوفر فرصة لإعادة برمجة التمثيل الغذائي على مستوى النسخ. هذا النهج جذاب في سياق الأمراض الأيضية والعدوى الفيروسية ، حيث يمكن أن يؤدي الاستهداف الصيدلاني لمنظمي النسخ إلى إعادة توصيل حالات التمثيل الغذائي المزمنة.

في هذا العمل ، درسنا آثار عدوى فيروس التهاب الكبد سي على خلايا الكبد البشرية الأولية. أظهرت الزراعة المشتركة لخلايا الكبد البشرية الأولية مع الخلايا البطانية L-SIGN + عدوى قوية تؤثر على 50٪ من الخلايا (الشكل 1) ، مقارنةً بمعدلات العدوى المُبلغ عنها سابقًا والتي تبلغ 6-10٪ (المرجع 10). تم العثور على معدلات إصابة مماثلة ، تتراوح من 20٪ إلى 50٪ في الجسم الحي 34 ، 35. على النقيض من العمل السابق على خلايا Huh7 ، فإن عدوى خلايا الكبد الأولية أعادت إنتاج تراكم الدهون ونقص شحميات الدم ، والسمات السريرية للعدوى ، ومطابقة التوقيع النسخي والتمثيل الغذائي لعينات المرضى (الشكل 6). سمح لنا هذا بتتبع التغيرات الأيضية بثقة وربط هذه التغييرات بمنظمي النسخ الأساسيين (الأشكال 3 ، 4 ، 5).

يعد تأثير عدوى HCV على تعبير CYP450 مجالًا ذا أهمية كبيرة للتطوير الصيدلاني ، ولا يمكن دراسته في خلايا Huh7 ، حيث تظهر الأورام الحد الأدنى من التعبير عن إنزيمات CYP450. نظهر أن HCV ينظم CYP3A4 على حد سواء في المختبر و في الجسم الحي (الشكل 5). ستؤثر هذه الزيادة على معدلات تصفية الأدوية المضادة للفيروسات الناشئة التي هي ركائز CYP3A4 ، مثل telaprevir و boceprevir و simeprevir.

نوضح أيضًا أن عدوى HCV لخلايا الكبد الأولية تحفز تحلل الجلوكوز فوق الفسفرة المؤكسدة بطريقة مشابهة لعدوى HCMV للخلايا الليفية 2 وتأثير Warburg في السرطان 36،37. على الرغم من أن زيادة تحلل السكر قد لوحظ سابقًا في خلايا Huh7.5 المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي عن طريق التحليل البروتيني 6 ، فإن الفسفرة المؤكسدة وأيض الجلوتامين 6. يشير هذا إلى أن التنظيم العالمي للمسارات الأيضية التي تم الإبلاغ عنها سابقًا كان نتيجة الانتظام الناجم عن فيروس التهاب الكبد الوبائي لتكاثر Huh7.5 ، بدلاً من استجابة المضيف للعدوى 38. في المقابل ، يُظهر نموذجنا تحفيزًا مذهلاً لتحلل السكر على الفسفرة المؤكسدة في كل من خلايا الكبد البشرية الأولية وخلايا Huh7.5 التي تم إيقاف النمو (الشكل التكميلي 10) ، مما يعزز الأدلة السابقة على تحلل السكر الناجم عن HCMV في الخلايا الليفية المتعطشة في المصل 2.

أظهر بحث غير متحيز عن منظمات التمثيل الغذائي أن HNF4α ، وهو مستقبل نووي مرتبط بـ MODY 39 ، له دور حاسم في استجابة المضيف حال السكر. على الرغم من وجود تقارير متضاربة بشأن HNFs في عدوى HCV 40،41 ، فإن عملنا يظهر بوضوح أن تثبيط HNF4α يعكس تحلل السكر في الخلايا المصابة. قمع تحلل الجلوكوز بواسطة Medica16 أو BI6015 أو مثبطات حال السكر 2DG و BrPA منعت تكرار HCV نتيجة لتقييد الركيزة (الشكل 3). الأهم من ذلك ، أن العلاج زاد أيضًا من موت الخلايا المبرمج في الخلايا المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي ، مما يشير إلى أن العملية مدفوعة باعتماد العائل على الطاقة غير المؤكسدة (الشكل 2) بدلاً من احتياجات الفيروس.

ثبت أن تفكك التمثيل الغذائي للدهون أكثر تعقيدًا. اقترح التحليل المبكر للخلايا المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي تحريض متعدد الأغراض لكل من أكسدة الأحماض الدهنية وتكوين الدهون 6. يتم تحفيز تكوين الدهون بالمثل في عدوى HCMV وأنواع معينة من السرطان 42 ، ولكن ليس في عدوى HCV لخلايا الكبد الأولية. في الواقع ، ثبت مؤخرًا أن بيروكسيد الدهون يخفف من تكاثر التهاب الكبد الوبائي ويخرج 43،44. تظهر نتائجنا الحث المعتمد على PPARα لأكسدة الأحماض الدهنية والقمع المعتمد على FXR لتخليق الكوليسترول الحيوي (الشكل 4). التنشيط المماثل لـ FXR له دور حاسم في تسرطن الكبد 45. هذه النتائج مثيرة للدهشة ، حيث يعتمد فيروس التهاب الكبد C على التخليق الحيوي للكوليسترول لترسيخ العامل المساعد NS5A من خلال FBL2 (المرجع 46) وعلى قطرات الدهون للتكاثر والخروج المعتمد على البروتين الدهني 29،47. الأهم من ذلك ، أن تثبيط أي من المستقبلات النووية ، أو أكسدة الأحماض الدهنية بشكل مباشر ، تسبب في زيادة كبيرة في تكاثر HCV ، مما يشير إلى أنه على عكس HNF4α ، فإن تأثيرات PPARα و FXR هي جزء من استجابة مضيفة مضادة للفيروسات.

باختصار ، يوفر عملنا بصمة استقلابية لعدوى التهاب الكبد الفيروسي في خلايا الكبد البشرية الأولية ، مع تعيينها لمنظمات النسخ التي يمكن تعديلها صيدلانيًا. نظهر أن العدوى الفيروسية تؤثر بشكل كبير على استقلاب المضيف ، ولكن ليس دائمًا لصالح الفيروس. تُظهر النتائج أن احتياجات الفيروسات يمكن أن تتعارض مع متطلبات المضيف للطاقة وأن تكاثر الفيروس قد يتم التحكم فيه بإحكام من خلال التفاعلات الإيجابية والسلبية مع المضيف 48.


مقدمة

لا تزال أمراض الأورام مثل سرطان الثدي والقولون والمستقيم أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المبكرة بين الناس. إن الكفاءة المنخفضة للطب المعاصر في علاج هذه الأورام الخبيثة يتم توسطها إلى حد كبير من خلال الفهم السيئ للعمليات التي ينطوي عليها الانتشار النقيلي للخلايا السرطانية بالإضافة إلى الخصائص النشطة الفريدة للميتوكوندريا من الأورام. تدعم المعرفة الحالية فكرة أن خلايا سرطان الثدي والقولون والمستقيم البشرية تظهر معدلات متزايدة من استهلاك الجلوكوز تظهر النمط الظاهري لـ Warburg ، أي ارتفاع تحلل السكر حتى في وجود الأكسجين (Warburg and Dickens ، 1930 Warburg ، 1956 Izuishi et al. ، 2012). على الرغم من ذلك ، هناك بعض الأدلة على أن الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا (OXPHOS) في هذه الأورام الخبيثة هي المصدر الرئيسي لـ ATP بدلاً من تحلل السكر. تم تصنيف الخلايا السرطانية وفقًا لنمطها في إعادة التشكيل الأيضي اعتمادًا على التوازن النسبي بين تحلل السكر الهوائي و OXPHOS (بيلانس وآخرون ، 2012). النوع الأول من الخلايا السرطانية هو نسبة عالية من السكر ، والثاني ينقص OXPHOS والنوع الثالث من الأورام التي تظهر OXPHOS المعزز. تشير الدراسات الحديثة بقوة إلى أن الخلايا السرطانية يمكن أن تستخدم اللاكتات والأحماض الدهنية الحرة وأجسام الكيتون والزبدة والجلوتامين كركائز تنفسية رئيسية تؤدي إلى إعادة تشكيل التمثيل الغذائي للخلايا المحيطة الطبيعية نحو تحلل السكر الهوائي & # x02014 & # x0201Creverse Warburg & # x0201D Effect (Whitaker-Menezes et al. ، 2011 Salem et al.، 2012 Sotgia et al.، 2012 Witkiewicz et al.، 2012). في الخلايا الطبيعية ، عادة ما يرتبط نظام OXPHOS ارتباطًا وثيقًا بأنظمة نقل الفوسفور ، بما في ذلك أنواع مختلفة من الكرياتين كيناز (CK) ، والتي تضمن التشغيل الآمن لمواد الطاقة على نطاق واسع من الأنشطة الخلوية (Dzeja and Terzic ، 2003). ومع ذلك ، فإن معرفتنا الحالية حول وظيفة نظام CK / الكرياتين (Cr) في سرطان الثدي والقولون والمستقيم البشرية غير كافية. في بعض الأورام الخبيثة ، على سبيل المثال الأورام اللحمية ، تبين أن نظام CK / Cr منخفض التنظيم بشدة (Bera et al. ، 2008 Patra et al. ، 2008). أظهرت دراساتنا السابقة أن نشاط CK (MtCK) المرتبط بالميتوكوندريا قد انخفض بشكل كبير في الخلايا السرطانية HL-1 (Monge et al. ، 2009) ، مقارنة بخلايا القلب الأصلية الطبيعية حيث OXPHOS هو المصدر الرئيسي لـ ATP و نظام CK هو ناقل رئيسي للطاقة. في هذه الدراسة ، قدرنا دور MtCK في الحفاظ على توازن الطاقة في خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية.

يتطلب فهم التحكم في استقلاب الطاقة وتنظيمه أدوات تحليلية تأخذ في الاعتبار التفاعلات الحالية بين مكونات الشبكة الفردية وتأثيرها على وظيفة الشبكة النظامية. تحليل التحكم الأيضي (MCA) هو إطار نظري يتعلق بخصائص أنظمة التمثيل الغذائي بالخصائص الحركية لمكوناتها الأنزيمية الفردية (Fell ، 2005). تم بالفعل تطبيق نهج تجريبي لـ MCA بنجاح على دراسات OXPHOS في الميتوكوندريا المعزولة (Tager et al. ، 1983 Kunz et al. ، 1999 Rossignol et al. ، 2000) وفي ألياف العضلات ذات الجلد (Kuznetsov et al. ، 1997) Tepp وآخرون ، 2010).

طبقت الأعمال الأخيرة من مجموعات Moreno-Sanchez و Westerhoff & # x00027s MCA للتحقيق في التحكم في تدفق تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية التي تنمو في الثقافة. الاستنتاج الرئيسي لهذه الدراسات هو أن أهمية OXPHOS في الطاقة الحيوية للخلايا السرطانية يجب إعادة تقييمها وتحديدها تجريبياً لكل نوع معين من الأورام (Marin-Hernandez et al. ، 2006 Moreno-Sanchez et al. ، 2007 ، 2008 ، 2010). أشارت هذه النتائج أيضًا إلى أن MCA قد يكون نهجًا مفيدًا جدًا للدراسة فى الموقع تنفس الميتوكوندريا وتدفق الطاقة.

في العمل الحالي قمنا بتطبيق MCA ل فى الموقع يدرس استقلاب الطاقة في الخلايا السرطانية البشرية. باستخدام Oxygraphy و MCA في خلايا سرطان الثدي والقولون والمستقيم البشرية المنفصلة (Kuznetsov et al. ، 1997) قمنا كميًا بتمييز التحكم الذي تمارسه المكونات المختلفة للسلسلة التنفسية ومركب ATP (Tepp et al. ، 2011).


15.2: تحليل التحكم الأيضي - علم الأحياء

تسمح طفرة واحدة في جين GSTe2 بتتبع المقاومة الأيضية للمبيدات الحشرية في ناقل رئيسي للملاريا

15 2 R27 http://genomebiology.com/2014/15/2/R27

2014 ريفيرون وآخرون. المرخص له BioMed Central Ltd. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) ، والذي يسمح بالاستخدام والتوزيع والاستنساخ غير المقيد بأي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح. ينطبق تنازل المشاع الإبداعي عن الملكية العامة (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) على البيانات المتاحة في هذه المقالة ، ما لم يُنص على خلاف ذلك.

تعتبر المقاومة الأيضية للمبيدات الحشرية أكبر تهديد لاستمرار فعالية مكافحة ناقلات الملاريا. ومع ذلك ، فإن أساسه الجزيئي الأساسي ، وهو أمر حاسم لإدارة المقاومة الناجحة ، لا يزال ضعيفًا.

هنا ، نوضح أن تغير الحمض الأميني الفردي L119F في جين الجلوتاثيون S- ترانسفيراز المنتظم ، GSTe2 ، يمنح مستويات عالية من المقاومة الأيضية للـ دي.دي.تي في ناقل الملاريا Anopheles funestus. كشف تحليل النسخ على مستوى الجينوم أن GSTe2 كان أكثر جين إزالة السموم تم التعبير عنه بشكل مفرط في DDT والبعوض المقاوم للبيرميثرين من بنين. أظهر التعبير المعدّل وراثيًا لـ GSTe2 في ذبابة الفاكهة السوداء أن النسخ المفرط لهذا الجين وحده يمنح مقاومة DDT ومقاومة متصالبة للبيروثرويدات. أثبت تحليل تعدد الأشكال GSTe2 أن طفرة النقطة ترتبط ارتباطًا وثيقًا بمقاومة الأيض للـ دي.دي.تي وأن توزيعها الجغرافي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بأنماط مقاومة الـ دي.دي.تي عبر إفريقيا. يدعم التوصيف الوظيفي لـ GSTe2 المؤتلف دور طفرة L119F ، حيث يكون الأليل المقاوم أكثر كفاءة في استقلاب الـ دي.دي.تي من الأليل الحساس. الأهم من ذلك ، نظهر أيضًا أن GSTe2 تستقلب مباشرة بيرثرويد بيرميثرين. يكشف التحليل الإنشائي أن الطفرة تمنح المقاومة عن طريق توسيع تجويف ربط GSTe2 DDT ، مما يؤدي إلى زيادة الوصول إلى الـ دي.دي.تي والتمثيل الغذائي. علاوة على ذلك ، نظهر أن GSTe2 يخضع لانتقاء اتجاهي قوي في المجموعات المقاومة ، ويلاحظ وجود قيود على تدفق الجينات بين المناطق الأفريقية ، مما يتيح التنبؤ بالانتشار المستقبلي لهذه المقاومة.

توفر علامة المقاومة الأيضية الأولى القائمة على الحمض النووي في البعوض أداة أساسية لتتبع تطور المقاومة وتصميم استراتيجيات مناسبة لإدارة المقاومة.

تعد تدخلات المكافحة القائمة على المبيدات الحشرية ، ولا سيما الناموسيات طويلة الأمد (LLINs) والرش الموضعي للأماكن المغلقة (IRS) ، من المكونات الرئيسية لمكافحة الملاريا في إفريقيا. لسوء الحظ ، فإن زيادة المقاومة لفئات المبيدات الحشرية المتوفرة في جميع أنحاء إفريقيا في ناقلات الملاريا الرئيسية ، مثل بعوض Anopheles funestus ، يهدد استمرار فعالية أدوات المكافحة هذه. يعد توضيح الأساس الجزيئي لمقاومة المبيدات الحشرية في هذه النواقل أمرًا بالغ الأهمية لتصميم استراتيجيات مناسبة لإدارة المقاومة ومنع العواقب المدمرة المحتملة على الصحة العامة 1.

خصائص مقاومة الـ دي.دي.تي لفطريات الأنوفيلة في بعوض بنين والكاميرون

تحليل ميكروأري النسخ على نطاق الجينوم

الملف الإضافي 1: الشكل S1

تنميط النسخ والتحليلات الوظيفية لـ GSTe2. (أ) مخطط بركان يُظهر نمط التعبير التفاضلي بين بعوض بنين المقاوم للـ DDT وسلالة FANG الحساسة ، مع قطع تغيير مزدوج و P & # 8201 & lt & # 82010.01. يتم تمييز GSTe2 كواحد من أكثر الجينات تنظيمًا في بعوض بنين. (ب) التحقق من صحة qRT-PCR من تنظيم ميكروأري لجينات إزالة السموم الرئيسية التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين عينات الـ دي.دي.تي المقاومة والحساسة. c738 عبارة عن نازعة هيدروجين قصير السلسلة (مُدمج_c738) يتم تنظيمه وفقًا للمصفوفة الدقيقة. (ج) التعبير النسبي عن التحوير GSTe2 في سلالة D. melanogaster Act5C-GSTe2 المعدلة وراثيًا وعينة التحكم مع عدم وجود تعبير جيني. البيانات المعروضة هي متوسط ​​الخطأ المعياري & # 8201 & # 177 & # 8201 للمتوسط ​​(n & # 8201 = & # 82013). (د) اختبارات اختبار Deltamethrin الحيوية على ذباب Act5C- GSTe2 المعدّل وراثيًا (Exp-GSTe2) وسلالات التحكم (اثنان من الأبوين (UAS-GSTe2 و GAL4-Actin) و F1 ذرية لا تعبر عن التحوير GSTe2 (تابع- NO)).

الجينات المنتظمة في سكان بنين المقاومين للـ دي.دي.تي Anopheles funestus بعد ميكروأري

تقويم العظام في أنوفيليس غامبيا

مصحح ص القيمة

سجل 2أضعاف التغيير

الجلوتاثيون S- ترانسفيرازات

الجلوتاثيون S- ترانسفيراز gste2

الجلوتاثيون S- ترانسفيراز gste2

نازعات الهيدروجين قصيرة السلسلة

البروتين الجلدي المخصص للبالغين ACP-20

البروتين الجلدي المخصص للبالغين ACP-20

بروتينات الربط الرائحة

مستقبلات الرائحة المرشح

بروتين رابط الرائحة 4

بروتين رابط الرائحة 4

بروتين سيرين المجال كليب

سيرين ثريونين بروتين كيناز ريو 1

بروتين الصدمة الحرارية cognate isoform a

UDP (يوريدين ثنائي الفوسفات) غلوكوز ترانسفيراز

بروتين التخليق الحيوي للبيورين ثنائي الوظيفة

بروتين التخليق الحيوي للبيورين ثنائي الوظيفة

سينثيز ATP سليفة الميتوكوندريا المرتبطة بالدهون

ملف إضافي 2: الجدول S1

الجينات الخاضعة للتنظيم في مجموعة بنين المقاومة للـ دي.دي.تي في آن. فطر.

كان جين إزالة السموم الأكثر تنظيمًا في بنين هو جين الجلوتاثيون S-ترانسفيراز ، GSTe2 ، مع تغيير أضعاف (FC) قدره 11.9 (P & # 8201 = & # 82010.0076) (الجدول & # 160 1 وملف إضافي 3: الجدول S2 إضافي ملف 1: الشكل S1A). يتم دعم اتساق هذا التنظيم أيضًا من خلال حقيقة أن كلا المجسين المصممين لـ GSTe2 قد تم تنظيمهما في مجتمع Pahou (الجدول رقم 160 1). علاوة على ذلك ، تم أيضًا تنظيم أطباء تقويم العظام من GSTe2 في سلالات مقاومة للـ دي.دي.تي في أنواع البعوض الأخرى مثل An. gambiae 3 7 و Aedes aegypti 8 ، مما يشير إلى أن هذا الجين يلعب على الأرجح دورًا رئيسيًا في مقاومة الـ دي.دي.تي في العديد من أنواع البعوض.

الملف الإضافي 3: الجدول S2

معلمات التباين الجيني لـ GSTe2 للبعوض المقاوم (الحي) والحساس (الميت) من Kpome (بنين).

وثيقة PDF تحتوي على نتائج ومناقشة تكميلية.

التحقق من صحة تنظيم ميكروأري باستخدام RT-PCR الكمي

أكد PCR الكمي للنسخ العكسي (qRT-PCR) التنظيم الكبير لـ GSTe2 في بنين (FC & # 8201 = & # 820144.8 ، P & # 8201 = & # 82010.007) (ملف إضافي 1: الشكل S1B) بالمقارنة مع FANG عرضة للإصابة أضنى. يتم نسخ جين GSTe2 بشكل كبير في البعوض المعرض للـ DDT مقارنة بالبعوض غير المكشوف (FC & # 8201 = & # 820182.0 مقابل 44.8 ، P & # 8201 & lt & # 82010.05) (الشكل # 160 1 أ) ، مما يشير إلى أن تحريض GSTe2 يحدث في بالإضافة إلى الإفراط في التعبير التأسيسي في البعوض المقاوم. يرتبط نمط التعبير عن GSTe2 عبر إفريقيا بشكل كبير بأنماط مقاومة الـ دي.دي.تي. هذا الجين هو 69.5 و 79.1 ضعفًا منظمًا في بعوض شديد المقاومة للـ دي.دي.تي من بنين (P & # 8201 & lt & # 82010.05) مقارنة بعينات موزمبيق وملاوي المعرضة تمامًا لمادة DDT ، على التوالي (الشكل # 160 1 أ). إنه منظم 35 ضعفًا (P & # 8201 & lt & # 82010.05) مقارنة بالعينات الأوغندية (مقاومة متوسطة للـ DDT 9). وبالمثل ، كان لدى اثنين من P450s CYP6P9a و CYP6P9b 2.96 و 7.13 مرة تعبير أكثر في البعوض من Pahou مقارنة بعوض FANG المعرض للإصابة.

تعبير GSTe2 والتحليل الوظيفي

ضريبة السلع والخدمات 2 التعبير والتحليل الوظيفي. (أ) مقارنة qRT-PCR لفحص البعوض المقاوم للـ دي.دي.تي (بنين) والبعوض القابل للـ دي.دي. (ب) اختبارات مقايسة DDT الحيوية على ذباب Act5C-GSTe2 المعدّل وراثيًا (Exp-GSTe2) وسلالات التحكم (اثنان من الأبوين (UAS-GSTe2 و GAL4-actin) و F1 ذرية لا تعبر عن التحوير GSTe2 (تابع- NO)). (ج) نفس المقايسات الحيوية مع البيرميثرين. (د) نشاط استقلابي للـ دي.دي.تي (معدل النضوب بعد 1 و 160 ساعة) من أليلات GSTe2 (متوسط ​​الانحراف المعياري # 8201 & # 177 & # 8201). (هـ) Michaelis & # 8211 حركية إنزيم مينتيني لأليلات GSTe2 المقاومة والحساسة (F) نشاط استقلاب بيرميثرين (معدل النضوب بعد 1 و 160 ساعة) للأليل 119 & # 160F GSTe2 (متوسط ​​& # 8201 & # 177 & # 8201 الانحراف القياسي). DDT ، ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان MAL ، ملاوي MOZ ، موزمبيق qRT-PCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي UG ، أوغندا ، DDE ، ثنائي كلورو ثنائي كلورو إيثيلين.

التعبير المعدّل وراثيًا عن GSTe2 في ذبابة الفاكهة

لتحديد ما إذا كان تنظيم GSTe2 وحده يمكنه منح DDT ومقاومة البيرثرويد ، تم إنشاء ذبابة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيًا التي تعبر عن GSTe2 المستنسخة من بنين باستخدام نظام GAL4 / UAS تحت برنامج تشغيل Act5C-GAL4 المنتشر في كل مكان (Act5C-GSTe2). بعد التأكد من التعبير عن GSTe2 في F المعدلة وراثيا1 ذرية بواسطة qRT-PCR (ملف إضافي 1: الشكل S1C) ، كشفت الاختبارات الحيوية أن ذباب Act5C-GSTe2 المعدّل وراثيًا كان مقاومًا لـ 4٪ DDT (19.1٪ معدل وفيات بعد التعرض لمدة 24 ساعة و 160 ساعة) ، في حين أن جميع عناصر التحكم التي لم تزيد - كانت صريحة GSTe2 حساسة (83.5٪ إلى 97.9٪ وفيات ، P & # 8201 & lt & # 82010.0001) (الشكل رقم 160 1 ب). تشير هذه النتائج إلى أن تنظيم GSTe2 وحده كافٍ لمنح مقاومة DDT. تم أيضًا استخدام نهج التعبير المعدّل وراثيًا هذا مؤخرًا بنجاح لتأكيد مشاركة اثنين من P450s (CYP6P9a و CYP6P9b) في منح مقاومة البيرثرويد في An. funestus 5 وسابقًا في ذبابة الفاكهة 13 ، مما يشير إلى فائدة هذه التقنية.

الكشف عن علامات المقاومة في GSTe2

لاكتشاف علامات المقاومة لـ GSTe2 ، قمنا بتحليل cDNA كامل الطول (666 # 160bp) من بعوض بنين المقاوم ، وأربع سلالات من البعوض المعرضة للإصابة من أوغندا وملاوي وموزمبيق وزامبيا. كان هناك 19 موقعًا متعدد الأشكال (8 بدائل) من 24 مستنسخة. كان الاختلاف الرئيسي في سلالة بنين هو الليوسين الثابت (CTT) لاستبدال الفينيل ألانين (TTT) (L119F). تشكل أنماط الفردانية في بنين كليدًا فريدًا مقارنةً بالأنماط الفردانية من البلدان الأخرى (الشكل رقم 160 2 أ).

تعدد الأشكال GSTe2 ومقاومة DDT

ضريبة السلع والخدمات 2 تعدد الأشكال ومقاومة DDT. (أ) شجرة الاحتمالية القصوى لـ GSTe2 (كدنا) عبر إفريقيا. (ب) كما هو الحال في (A) ، ولكن مع البعوض المقاوم للـ DDT (AL) والبعوض (DE) المقاوم للـ DDT في بنين (الحمض النووي الجيني). (ج) شبكة النمط الفرداني GSTe2 (TCS) بين البعوض الحساس والمقاوم (بنين). يعكس حجم المضلع تردد النمط الفرداني. كل عقدة تمثل طفرة (رقم). (د) ملف تعريف تعبير GSTe2 للأنماط الجينية L119F الثلاثة في الكاميرون (Gounougou). BN ، Benin DDT ، ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان MAL ، ملاوي UG ، أوغندا ZB زامبيا.

تم تأكيد تحليل GSTe2 كامل الطول (881 & # 160bp بما في ذلك الإنترونات) لستة بعوض مقاوم وستة بعوض حساس من موقع آخر في بنين (Kpome، 6 & # 17655 & # 8242N، 2 & # 17619 & # 8242E ، نظرًا لعدم توفر بعوض حساس من باهو) أن تعدد الأشكال GSTe2 كان مرتبطًا بمقاومة DDT. لم يتم تحديد تعدد الأشكال للبعوض المقاوم وكان هناك نمط فرداني واحد (Hap1-R) يحمل أليل المقاومة 119 & # 160F (الشكل رقم 160 2 ب ، ملف إضافي 3: الجدول S2). تم تحديد خمسة مواقع متعددة الزيجوت غير المتجانسة للبعوض الحساس مع تغيير حمض أميني واحد ، L119F. كما لوحظ وجود نمط فرداني حساس Hap2-S يحمل الأليل الحساس L119 (الشكل & # 160 2 ب ، ج).

الارتباط بين طفرة L119F ومقاومة DDT و pyrethroid

اكتشف اختبار TaqMan ، المصمم لضبط النمط الوراثي لطفرة L119F ، بشكل لا لبس فيه الأنماط الجينية الثلاثة (ملف إضافي 5: الشكل S2A) في 35 بعوضة حساسة و 35 مقاومة من Gounougou (9 & # 17605 & # 8242N، 13 & # 17640 & # 8242E) في الكاميرون (الغرب -وسط إفريقيا) (حيث تم الحصول على عدد قليل جدًا من البعوض الحساس من بنين). اختلف توزيع ترددات التركيب الوراثي بين البعوض الحساس والمقاوم بشكل كبير (& # 967 2 & # 8201 = & # 820199.7 ، درجات الحرية & # 8201 = & # 82012 و P & # 8201 & lt & # 82010.0001) (الشكل & # 160 3 ب) . لوحظ ارتباط كبير بين طفرة L119F ومقاومة DDT ، مع نسبة أرجحية قدرها 5.74 (P & # 8201 & lt & # 82010.0001) عند مقارنة تواتر الأليلات المقاومة والحساسة في كلتا مجموعتي العينات. عند مقارنة تواتر الأنماط الجينية متماثلة اللواقح (T / T و C / C) ، كان النمط الوراثي المتحولة T / T أكثر ارتباطًا بمقاومة DDT من النمط الجيني C / C البري بنسبة أرجحية تبلغ 22.3 (P & # 8201 & lt & # 82010.0001). في الواقع ، كان 72.5 ٪ من البعوض الذي يحتوي على أليل متحور متماثل الزيجوت (T / T) مقاومًا لمادة الـ دي.دي. C) كانت مقاومة لـ DDT ، مما يشير إلى سيطرة مشتركة لهذا الأليل (الشكل رقم 160 3 ب). يشير ارتباط طفرة L119F بمقاومة الـ دي.دي.تي إلى أنه يمكن استخدام مقايسة TaqMan هذه كأداة تشخيصية لاكتشاف ورسم خريطة توزيع مقاومة الـ دي.دي.تي في آن. funestus في إفريقيا.

الملف الإضافي 5: الشكل S2

الكشف عن أليل المقاومة 119 & # 160F GSTe2 في An. فطر. (أ) نتائج الفحص التشخيصي TaqMan للتنميط الجيني L119F ، مع تحديد ثلاثة أنماط جينية بشكل لا لبس فيه (ثلاث مجموعات). (ب) يُظهر توزيع النمط الجيني لأليلات L119F عبر تسعة بلدان في إفريقيا وجود علاقة قوية بين الأنماط الجينية L119F والأنماط المعروفة لمقاومة الـ دي.دي.تي. على سبيل المثال ، تم إصلاح النمط الجيني 119 & # 160F (T / T) في مجموعة بنين شديدة المقاومة للـ دي.دي.تي ولكنها غائبة تمامًا في سكان جنوب إفريقيا المعرضين تمامًا للإصابة (مالاوي وموزمبيق وزامبيا). (ج) تقييم العلاقة بين أليلات L119F والنمط الظاهري المقاوم للبيرميثرين (النوع الأول من البيرثرويد). (د) تقييم العلاقة بين أليلات L119F والنمط الظاهري المقاوم لامدا-سيهالوثرين (النوع الثاني من البيرثرويد).

ارتباط L119F بمقاومة DDT وتنوع GSTe2 عبر إفريقيا

ارتباط L119F بمقاومة DDT و ضريبة السلع والخدمات 2 تقلب عبر أفريقيا. (أ) دليل على الارتباط القوي بين الأنماط الجينية L119F ومقاومة DDT في Gounougou (الكاميرون) (25 مقاومة و 25 حساسًا). (ب) التوزيع التفاضلي للأنماط الجينية L119F بين البعوض المقاوم للـ دي.دي.تي والحساس بالـ دي.دي.تي. (ج) يرتبط التوزيع الجغرافي لـ L119F عبر إفريقيا بتوزيع مقاومة الـ دي.دي.تي. (د) شبكة النمط الفرداني GSTe2 (TCS) (مناطق الترميز فقط) عبر إفريقيا ، مع واجهات مقاومة (رمادية) وقابلة للتأثر (كستنائي) محددة بواسطة L119F. يتم تمثيل كل نمط فرداني بشكل دائري أو مستطيل والحجم المتناسب مع تردده في العينة بينما يتم تمثيل الخطوات الطفرية بأرقام الخطوط. (هـ) المسافات الجينية بين ستة مجموعات أفريقية بناءً على تسلسل GSTe2 (تقديرات Nst). DDT ، ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان.

في المقابل ، كانت مقاومة الـ دي.دي.تي أكثر ارتباطًا بطفرة L119F من مستوى الإفراط في التعبير GSTe2 (الشكل رقم 160 2 د). في الواقع ، على الرغم من التغيير المنخفض في النمط الجيني L119 الحساس ، لم يلاحظ أي فرق كبير (P & # 8201 & gt & # 82010.05) في مستوى تعبير GSTe2 بين RR المقاوم متماثل الزيجوت (FC & # 8201 = & # 820126.6) ، متغاير الزيجوت RS (FC & # 8201 = & # 820123) و SS حساسًا للزيجوت المتماثل (FC & # 8201 = & # 820116.5) (الشكل # 160 2 د). تشير هذه النتائج إلى أن طفرة L119F يمكن أن تكون السبب الرئيسي لمقاومة الـ دي.دي.تي.

التوزيع الجغرافي لطائرة L119F عبر إفريقيا

المقايسات الأيضية مع إنزيم GSTe2 غير المتجانسة

كشف تقييم لنشاط نازعة هيدروكلوريناز DDT للإنزيم المقاوم المؤتلف 119 & # 160F (بنين) وتلك الخاصة بـ L119 الحساس أن أليل 119 & # 160F أكثر كفاءة بمقدار 3.4 مرة في استقلاب الـ دي.دي.تي (82.9٪ استنفاد DDT بعد تفاعل 1 & # 160 ساعة في ال وجود العامل المساعد الجلوتاثيون (GSH) P & # 8201 & lt & # 82010.001) من أليل L119 (استنفاد 24.4٪) (الشكل رقم 160 1 D والملف الإضافي 6: الشكل S3A). تم تأكيد ذلك من خلال المعلمات الحركية الخاصة بكل منهما (الشكل رقم 160 1 E) ، حيث يتمتع الأليل 119 & # 160F بكفاءة تحفيزية أعلى (kcat / K م نسبة) لـ DDT (316.3 & # 160 & # 956M & # 87221 .s & # 87221 مقابل 92.0 & # 160 & # 956M & # 87221 .s & # 87221) (الجدول & # 160 2).

الملف الإضافي 6: الشكل S3

النشاط الأيضي لـ GSTe2. (أ) استقلاب الـ دي.دي.تي بواسطة GSTe2 من بنين له ذروة عالية لمنتج مستقلب DDE. (ب) هناك انخفاض في ذروة استقلاب البيرميثرين بمقدار 119 & # 160F-GSTe2 في التفاعل مع GSTe2 (أزرق) مقارنةً بالتحكم (أسود) (ثلاثة مكررات) باستخدام ظروف متساوية. يشير السهم إلى المستقلبات المحتملة. (ج) استقلاب البيرميثرين الإضافي بواسطة إنزيم Benin GSTe2 باستخدام ظروف التدرج. تشير القمم الزرقاء إلى ملف التمثيل الغذائي لـ GSTe2 النشط بينما تشير القمم السوداء إلى خليط حضانة مصل الأبقار (تحكم سلبي). تشير الأسهم إلى المستقلبات الثلاثة المحتملة. تمت التصفية التحليلية باستخدام برنامج زيادة التدرج الخطي.

المعلمات الحركية للمقاومة (119 & # 160 فهرنهايت) والحساسية (L119) ضريبة السلع والخدمات 2 الأليلات

الخامس الأعلى(DDE & # 956mol.min 𕒵 .mg 𕒵 )

Kcat (s 𕒵 )

كات / ك م(& # 956M 𕒵 𕒵 )

تم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة لكل من الأليلات وأظهرت النتائج متوسط ​​الانحراف المعياري & # 8201 & # 177 & # 8201.

في المقابل ، لم يلاحظ أي استقلاب كبير للديلتاميثرين ، وهو ما يتماشى مع مقاومة الدلتامثرين المنخفضة التي لوحظت في الحقل في باهو (88 ٪ وفيات للدلتامثرين مقابل 66 ٪ للبيرميثرين) ، ولكن أيضًا مقاومة الدلتاميثرين المنخفضة التي لوحظت في UAS- المعدلة وراثيًا. ذبابة الفاكهة GSTe2.

التنوع الجيني لـ GSTe2 عبر إفريقيا

توقيع الاختيار الإيجابي على GSTe2 في بنين

كشف تحليل تسلسل الطول الكامل لـ 882 نقطة أساس لـ GSTe2 (663 & # 160 نقطة أساس للإكسونات الثلاثة و 219 & # 160 نقطة أساس للإنترونات وجزء من 3 & # 8242 UTR) من البعوض الذي تم جمعه ميدانيًا من ستة بلدان أن GSTe2 تحت اختيار اتجاهي قوي في بنين على عكس البلدان الأخرى (الجدول & # 160 3 وملف إضافي 7: الجدول S3 ، ملف إضافي 8: الشكل S4A). في الواقع ، يتضح الانخفاض الكبير في التنوع الجيني لـ GSTe2 في بنين من خلال موقع واحد متعدد الأشكال لوحظ في بعوضة واحدة من أصل 12 من باهو ، على عكس المواقع السبعة إلى تسعة عشر متعددة الأشكال في المجموعات السكانية الأخرى. كان هناك نمطان فردانيان فقط موجودان في بعوض باهو (كان النمط الفرداني الصغير موجودًا فقط كزيجوت متغاير الزيجوت في فرد واحد من بين اثني عشر فردًا) ، على عكس الأنماط الفردية السبعة إلى العشرة للبلدان الأخرى (ملف إضافي 8: الشكل S4A جدول & # 160 3) . تعد معلمات التنوع الجيني مثل تنوع النمط الفرداني (HD) وتنوع النيوكليوتيدات في بنين أقل بكثير من البلدان الخمسة الأخرى (ملف إضافي 8: الشكل S4A). يشير هذا التنوع المنخفض لـ GSTe2 لبعوض بنين إلى وجود اكتساح انتقائي عبر هذا الجين وحوله. سيحدد التقييم المستقبلي مدى هذا الاكتساح الانتقائي في هذه المنطقة الجينومية على الكروموسوم 2 & # 160L.

المعلمات الجينية بين مناطق الترميز وغير المشفرة لجميع الجينات الثلاثة في البلدان الثلاثة

جزء متسلسل كامل (882 & # 160 نقطة أساس)

منطقة غير مشفرة (219 & # 160 نقطة أساس)

2n ، عدد التسلسلات D ، إحصاءات Tajima & # 8217s ، إحصائيات D * ، Fu and Li & # 8217s h ، عدد الأنماط الفردانية hd ، تنوع النمط الفرداني ns ، غير مهم & # 960 ، تنوع النيوكليوتيدات مضروبًا في 10 3S ، عدد المواقع متعددة الأشكال & # 952 ، مقدر واترسون & # 8217 (لكل موقع) مضروبًا في 10 3.

الملف الإضافي 7: الجدول S3

معلمات التحديد لـ GSTe2 عبر إفريقيا.

الملف الإضافي 8: الشكل S4

أنماط تعدد الأشكال لـ GSTe2 في إفريقيا. (أ) قطعة من معلمات التنوع الجيني لـ GSTe2 عبر إفريقيا تشير إلى وجود اختيار اتجاهي قوي لـ GSTe2 في بعوض بنين. HD ، تنوع النمط الفرداني & # 960 ، تنوع النيوكليوتيدات. (ب) الأنماط الفردية لـ GSTe2 (الترميز وغير المشفر) عبر ستة بلدان في إفريقيا مع أنماط ظاهرية متناقضة للـ دي.دي.تي. يشار إلى المواضع متعددة الأشكال بأرقام فوق النيوكليوتيدات ، ويتم تمييز الأنماط الفردانية من 1 إلى 39 بالأحرف الأولى السابقة من البلد الذي يسود فيه النمط الفرداني. تشير علامة النجمة (*) إلى أن النمط الفرداني قد لوحظ في بلدان أخرى. N هو عدد الأفراد الذين يتشاركون في النمط الفرداني. (ج) نفس الشيء ولكن فقط النظر في مناطق الترميز. (د) نفس الشيء ولكن فقط مع مراعاة البدائل غير المترادفة التي توفر متغيرات البروتين المختلفة لـ GSTe2 عبر إفريقيا.

ومع ذلك ، فإن اختبارات الاختيار الأخرى مثل McDonald and Kreitman (MK) و Hudson & # 8211Kreitman & # 8211Aguade (HKA) و dN / dS و K أ / ك س لم تظهر اختبارات النسب و Tajima & # 8217s D أي توقيع للاختيار الإيجابي في بنين (ملف إضافي 7: الجدول S3). قد يكون هذا بسبب حقيقة أن الاكتساح حول GSTe2 في سكان بنين يقترب من التثبيت كما يتضح من التردد بنسبة 100 ٪ لأليل المقاومة 119 & # 160F في هذه المجموعة. في حالة قرب التثبيت من المسح الانتقائي ، يظهر الاختيار الاتجاهي بشكل أفضل من خلال انخفاض مستويات التباين الجيني 24. لم تُلاحظ أدلة على الانتقاء من خلال انخفاض التنوع الجيني في الكاميرون وغانا ، حيث تم اكتشاف مقاومة مادة الـ دي.دي.تي أيضًا ، وإن لم يكن على المستوى العالي كما هو الحال في بنين. ومع ذلك ، فإن وجود النمط الفرداني السائد المقاوم لبنن في بلدان غرب أفريقيا هذه ، وإن كان بوتيرة أقل ، يمكن أن ينتج عن التأثير المشترك لانتقاء الـ دي.دي.تي المحلي والهجرة.

توزيع النمط الفردي لـ GSTe2 عبر إفريقيا

تمت ملاحظة ما مجموعه 39 نمط فرداني للجين الكامل (ملف إضافي 8: الشكل S4B) ، 16 لمناطق الترميز فقط (ملف إضافي 8: الشكل S4C) ، وكان هناك سبعة متغيرات بروتينية (ملف إضافي 8: الشكل S4D) عبر إفريقيا . أنماط الفرد المقاومة (مع الأليل المقاوم 119 & # 160F) التي تم حلها حول النمط الفرداني السائد BN23 (ثابت تقريبًا في بنين وموجود فقط في المواقع المقاومة للـ دي.دي.تي) جميعها قللت من التنوع ، مما يدل على اختيار حديث مع عدد أقل من الأنماط الفردية (11 من أصل 39) ، والمزيد من التجانس (اختلافات أقل في الخطوة الطفرية & # 88044). تم حل الأنماط الفردانية الحساسة (مع أليل L119) حول النمط الفرداني السائد MAL3 وكانت أكثر تنوعًا ، مع المزيد من الأنماط الفردية (29 من 39) وتغايرية أكبر (حتى 13 اختلافًا في الخطوة الطفرية). بشكل عام ، يكشف توزيع النمط الفرداني لـ GSTe2 عبر إفريقيا (ملف إضافي 8: الشكل S4B ، C ، D) أن طفرة L119F هي تعدد الأشكال الرئيسي الذي يشكل التنوع الجيني GSTe2 مع الخطوة الطفرية في هذا الأليل الذي يحدد باستمرار مجموعة مقاومة وحساسية من أنماط الفرد (الشكل رقم 160 3 D وملف إضافي 9: الشكل S5).

الملف الإضافي 9: الشكل S5

شبكة Haplotype لـ GSTe2 كاملة الطول (مناطق الترميز وغير المشفرة) عبر إفريقيا. ينعكس تواتر كل نمط فرداني من خلال حجم مضلعها. تمثل كل عقدة طفرة منفصلة (يتم إعطاء موضع متعدد الأشكال أعلى الفروع). المضلعات باللون الرمادي هي أنماط فردانية مقاومة تحتوي على أليل 119 & # 160F المقاوم بينما تكون الأنماط الفردانية باللون الأبيض حساسة. تم وضع دائرة حول الموضع الطفري لـ 499 للإشارة إلى أن هذا الوضع متعدد الأشكال ، والذي يتوافق مع L119F ، هو المفتاح لتشكيل توزيع النمط الفرداني GSTe2.

البنية التحتية السكانية لـ GSTe2 عبر إفريقيا

أشار تحليل التنوع الجيني لـ GSTe2 إلى أن An. يتم تنظيم مجموعات الفطريات بشكل واضح وفقًا لنمط مقاومتها للـ دي.دي.تي وحسب المسافة الجغرافية. كشف إنشاء شجرة النشوء والتطور ذات الاحتمالية القصوى لتسلسل GSTe2 أن البعوض الكاميرون وغانا يتجمعان مع بعوض بنين (الشكل رقم 160 4) ، المرتبطة بملفات مقاومة DDT. السكان المعرضون للإصابة من موزمبيق وملاوي لديهم أدنى تمايز وراثي (K. شارع & # 8201 = & # 82010.016) (ملف إضافي 10: الجدول S4 الشكل & # 160 3 E). السكان الأوغنديون في شرق إفريقيا ذوي المقاومة المعتدلة لديهم تمايز متوسط ​​لجميع السكان. يرتبط هذا النمط من تدفق الجينات بأنماط التركيب الجيني لـ An. الفطريات في جميع أنحاء إفريقيا بناءً على علامات الأقمار الصناعية الدقيقة 26 ، مما يشير إلى وجود عوائق أمام تدفق الجينات بين الأنوف الأفريقي. الفطريات ، التي ستؤثر على انتشار الجينات المقاومة لمبيدات الحشرات.

الحد الأقصى لشجرة النشوء والتطور الخاصة بـ GSTe2 (مناطق الترميز وغير المشفرة) عبر إفريقيا

الحد الأقصى لشجرة النشوء والتطور ضريبة السلع والخدمات 2 (مناطق الترميز وغير المشفرة) عبر إفريقيا. اشتمل التحليل على 92 تسلسلًا (2 ن) مسماة. تم التخلص من جميع المواقف التي بها فجوات وبيانات مفقودة. كان هناك ما مجموعه 881 وظيفة في مجموعة البيانات النهائية. من الواضح أن الكليد المقاوم الذي يكون أقل تعددًا في الأشكال ويهيمن عليه سكان بنين يمكن تحديده بوضوح على يمين الشجرة بينما يوجد كليد حساس أكثر تنوعًا وأكثر عالمية على يسار الشجرة. BN ، Benin CAM ، الكاميرون GH ، غانا MAL ، ملاوي MOZ ، موزمبيق UG ، أوغندا.

الملف الإضافي 10: الجدول S4

التمايز الجيني باستخدام K. شارع.

الأساس الهيكلي لمقاومة الـ دي.دي.تي التي تمنحها GSTe2

تنقية GSTe2 وهيكل ثلاثي الأبعاد للأشعة السينية

تنقية GSTe2 وهيكل ثلاثي الأبعاد للأشعة السينية. (أ) كروماتوجرام استبعاد الحجم لأليلات GSTe2 من أليلات بنين (BN) وأوغندا (UG) وملاوي (MAL). توضح الخطوط الامتصاصية المسجلة عند 280 & # 8197 نانومتر. يشار إلى علامات الوزن الجزيئي (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، US) بالكيلو دالتون. (ب) هلام SDS-PAGE من الأليلات الثلاثة GSTe2 المنقى (26.8 & # 160 كيلو دالتون). (ج) تُظهر طوبولوجيا GSTe2 المحطات الطرفية C و N وجيب ربط GSH (موقع G) وجيب ربط الركيزة (موقع H). الاتحاد الأفريقي ، الوحدات التعسفية BN ، Benin GSH ، الجلوتاثيون MAL ، ملاوي MW ، الوزن الجزيئي UG ، أوغندا المجلد ، الحجم.

بشكل عام ، بنية BN-GSTe2 و UG-GSTe2 متشابهة جدًا (الشكل رقم 160 5 C ، ملف إضافي 11: الشكل S6). ومع ذلك ، يمكن ملاحظة اختلافات محلية كبيرة بين الأليلات في الأطراف الطرفية C لـ H4 (تحتوي على بقايا طفرة L119F من 113 إلى 128) و H8 (بقايا من 213 إلى 220) (الشكل & # 160 6 أ). يمكن وصف هذه الاختلافات بأنها حركة منسقة من حلزونات BN-GSTe2 H4 و H8 فيما يتعلق بتلك الموجودة في UG-GSTe2 ، والتي تفتح شق الموقع النشط. متوسط ​​الجذر التربيعي للانحراف (RMSD) بين الهياكل هو 0.64 & # 160 & # 197 لجميع ذرات C & # 945. هناك انخفاض كبير في RMSD بين الأليلات من 0.64 إلى 0.42 & # 160 & # 197 عند استبعاد H4 (الذي يحتوي على طفرة 119 & # 160F) ويكون RMSD 0.33 & # 160 & # 197 فقط عند استبعاد كل من H4 و H8. لوحظ وجود RMSD أعلى عند مقارنة الأليلين فقط مع الحلزون H4 (RMSD & # 8201 = & # 82010.9 & # 160 & # 197) (الشكل & # 160 6 أ). علاوة على ذلك ، فإن الاختلاف الكبير بين أليلات BN-GSTe2 و UG-GSTe2 يزداد تعقيدًا من خلال ملاحظة أن بنية أليل UG-GSTe2 تشبه إلى حد كبير بنية An. gambiae GSTe2 protein [PDB: 2imi] (RMSD & # 8201 = & # 82010.4 & # 160 & # 197) مقارنة بـ Benin-GSTe2 (RMSD & # 8201 = & # 82010.64 & # 160 & # 197) على الرغم من اختلاف 20-amino-acid ( تشابه 92٪) (الشكل & # 160 6 ب) ، مما يشير إلى أن طفرة L119F هي العامل الرئيسي الذي يعدل بنية GSTe2 (الشكل & # 160 6 ج).

الملف الإضافي 11: الشكل S6

لا تحتوي مطابقة جيب ربط GSH (موقع G) لأليل BN-GSTe2 المقاوم (أرجواني) وأليل UG-GSTe2 الحساس (الأخضر) على فروق ذات دلالة إحصائية. يتم تمثيل العامل المساعد GSH والبروتين الأحماض الأمينية وجزيئات الماء المرتبطة بالهيدروجين في وضع الكرة والعصا.

تكشف الاختلافات الهيكلية ثلاثية الأبعاد لـ GSTe2 أن L119F مهم لمقاومة الـ دي.دي.تي

تكشف الاختلافات الهيكلية ثلاثية الأبعاد لـ GSTe2 أن L119F مهم لمقاومة الـ دي.دي.تي. (أ) تراكب هياكل Benin-GSTe2 (أرجوانية) وأوغندا-GSTe2 (خضراء) ولقطة مقرّبة من حلزونات H4 / H8 التي تحتوي على طفرة L119F. (ب) تراكب أوغندا- GSTe2 (أخضر) و An. gambiae GSTe2 (الرمادية) تظهر تشابهها الشديد. (ج) مقارنة بين جيوب ربط الركيزة لـ Benin-GSTe2 (أرجواني) وأوغندا- GSTe2 (أخضر). (يسار) يوضح التمثيل السطحي الجزيئي لموقع H أن مادة DDT ترسو جيدًا في موقع ربط Benin-GSTe2 ولكنها تتعارض مع بنية Uganda-GSTe2. (يمين) لقطة مقرّبة لتأثير L119F على الموقع H (هذه الطفرة تنحني H4 ، مما يؤدي إلى زيادة تجويف ربط DDT في Benin-GSTe2 ولكن ليس بالنسبة لـ Uganda-GSTe2). Ct ، C- الطرفية DDT ، ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان GSH ، الجلوتاثيون Nt ، N- الطرف.

يمكن تقسيم الموقع النشط لـ GSTe2 إلى موقعين فرعيين. أولاً ، هناك موقع ارتباط الجلوتاثيون ، المسمى موقع G ، حيث يرتبط جزيء GSH. ثانيًا ، هناك موقع H ، الذي يتعرف على الركيزة الكارهة للماء. تم وصف بنية موقع G لهذه العائلة الفائقة من البروتينات جيدًا وهي مطابقة تقريبًا لتلك التي لوحظت في BN-GSTe2 و UG-GSTe2. على الرغم من وجود اختلافات طفيفة بين مواقع G لكلا الأليلين ، لا يوجد فرق كبير في التوافقية ، ولا تحتوي جيوب الربط G هذه على أي إعادة ترتيب رئيسية (ملف إضافي 11: الشكل S6). الموقع H عبارة عن تجويف كبير ومفتوح قليلاً مسعور بجوار موقع G. إنه مبني من مخلفات من حلقات مختلفة في مجال N-terminal ويشتمل بشكل ملحوظ على نهايات C المتغيرة من الحلزونات H4 و H8 في المجال C-terminal (الشكل & # 160 5 C). وبالتالي ، فإن الاختلافات التي لوحظت بين BN-GSTe2 و UG-GSTe2 تؤثر بشكل أساسي على بنية جيب ربط الركيزة (موقع H) (الشكل رقم 160 6 أ).

الجيب المفترض لربط الـ دي.دي.تي (H-site) وتفاعل استقلاب الـ دي.دي.تي

يشكل Leu119 عادةً جزءًا من النواة الكارهة للماء التي لا يمكن الوصول إليها والتي لا يمكن الوصول إليها والتي تعمل على استقرار تشكيل الحلزونات H4 و H5 و H8 الخاصة بأوغندا- GSTe2 (الشكل رقم 160 6 أ). ومع ذلك ، لاستيعاب السلسلة الجانبية الأكبر حجمًا Phe119 في بنية Benin-GSTe2 ، فإن الطرف N للطرف H4 له منحنى دراماتيكي ، مما يزيد من حجم موقع H مقارنة بأليل UG ، حيث يكون التجويف أضيق ( الشكل # 160 6 ج). يؤكد تمثيل سطح موقع H لكلا البروتينين مع GSH المرتبط أن أليل BN المقاوم يحتوي على تجويف افتراضي أكبر من DDT ​​من أليل UG الحساس (الشكل رقم 160 6 C).

لم تنجح محاولات التبلور المشترك للركيزة DDT أو منتج DDE مع BN-GSTe2 و UG-GSTe2. لذلك ، لاستكشاف خصائص ربط الركيزة لكل من الأليلين وتقييم قدرتها على تحلل مادة الـ دي.دي.تي ، تم إرساء جزيء الركيزة في موقع H (الشكل رقم 160 6 ج). أظهر هذا الالتحام لجزيء DDT في موقع H لكلا الأليلين أن Benin-GSTe2 له الحجم والشكل المناسبان لاستيعاب الـ DDT بشكل أفضل & # 8216 قريب من التشكل التفاعلي & # 8217. يتضمن ذلك التثبيت المناسب لحلقات كلوريد فينيل DDT والموضع الأمثل لـ DDT C & # 945 ، مشيرًا نحو الثيولات من الجلوتاثيون (الشكل # 160 6 C) مما يؤدي إلى زيادة استقلاب الـ دي.دي.تي. في المقابل ، لا يسمح موقع H الأصغر الخاص بأوغندا- GSTe2 بالتعرف على مادة الـ دي.دي. يفسر هذا الاختلاف في الموقع H زيادة إمكانية الوصول إلى الموقع النشط ، والنشاط الأعلى ، وبالتالي المقاومة العالية للـ دي.دي.تي لسكان بنين مقارنة بالسكان الآخرين مثل سكان أوغندا أو ملاوي.

الملف الإضافي 12: الشكل S7

تحليل مقارن لبنية موقع H لأليلات GSTe2 المختلفة و agGSTd1-6. يعد حجم الموقع وشكله من المحددات الرئيسية لقدرة استقلاب الـ دي.دي.تي. (أعلى) تمثيلات السطح الجزيئي لتلك البقايا التي تشكل الموقع H لأوغندا- GSTe2 (أخضر) ، بنين- GSTe2 (أرجواني) ، agGSTe2 (أبيض) و agGSTd1-6 (أصفر). تظهر ذرات الأكسجين والنيتروجين على السطح باللون الأحمر والأزرق على التوالي. (أسفل) تراكبات هياكل أوغندا- GSTe2 (خضراء) مع Benin-GSTe2 (أرجواني) و agGSTe2 (أبيض) و agGSTd1-6 (أصفر) توضح أن معظم الاختلافات موجودة في العناصر الهيكلية الثانوية المتعلقة بالموقع H.

يتم فصل بروتينات أليلات BN-GSTe2 و UG- GSTe2 بواسطة تغييرين في الأحماض الأمينية ، L119F و I131V. ومع ذلك ، يقع L119F فقط في H4 helix بينما يقع I131V في H5 helix ، حيث لم يلاحظ أي تغيير توافقي بين نماذج BN و UG. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي نموذج AgGSTe2 ، المشابه هيكليًا لـ UG-GSTe2 ، على I131 ، مثل نموذج BN. لذلك ، يشير هذا إلى أن طفرة I131V لا تلعب دورًا في نشاط استقلاب الـ دي.دي.تي لأليل BN ويؤكد أن الأساس الجزيئي لمقاومة الـ دي.دي. التغييرات التوافقية الهامة التي تحدثها طفرة L119F. تتفق هذه النتيجة مع ما توقعه سابقًا 27. اقترحت هذه الدراسة السابقة أن. gambiae GSTe2 لتكون أكثر نشاطًا ضد الـ دي.دي.تي ، كانت هناك حاجة لمزيد من التغييرات المطابقة في جيب ربط الـ دي.دي. هذه التغييرات هي بالضبط ما حدث في شكل بنين ، حيث أدى تغيير حمض أميني واحد إلى التعديل اللازم لاستيعاب المزيد من الـ دي.دي.تي في هذا النوع المقاوم. سلالة فطرية ، تمنح مستوى عالٍ من مقاومة الـ دي.دي.تي على عكس أليل UG ، حيث يكون هذا التعديل غائبًا. بشكل عام ، توضح هذه التحليلات الهيكلية أن طفرة L119F هي الطفرة المسببة التي تمنح مقاومة الـ دي.دي.تي.

تقدم هذه الدراسة تشريحًا شاملاً ومفصلاً للأساس الجيني والجزيئي والبنيوي للمقاومة الأيضية لمبيد حشري في ناقل رئيسي للملاريا. أولاً ، اكتشفنا بشكل قاطع الجين الرئيسي المسؤول وأظهرنا أن المقاومة تُمنح من خلال تغيير نوعي وكمي في إنزيم استقلاب الـ دي.دي.تي (GSTe2). ثانيًا ، اكتشفنا ، لأول مرة ، على حد علمنا ، بالنسبة لأنواع البعوض ، علامة مقاومة جزيئية لمقاومة التمثيل الغذائي وصممنا اختبارًا تشخيصيًا موثوقًا يعتمد على الحمض النووي يمكنه اكتشاف ورسم خريطة توزيع المقاومة عبر إفريقيا بدقة. ستكون أداة التشخيص هذه ذات قيمة لبرامج مكافحة ناقلات الأمراض حيث يمكن اكتشاف المقاومة في مرحلة مبكرة ، مما يسمح بتنفيذ استراتيجيات مناسبة لإدارة المقاومة. ثالثًا ، أظهرنا أن التوزيع الجغرافي لمقاومة الـ دي.دي.تي وأصلها وأنماط انتشارها المستقبلية يمكن تحديدها أو التنبؤ بها بناءً على أنماط التنوع الجيني GSTe2 ، والتي ترجع أساسًا إلى طفرة L119F الفردية.

أنثى بالغة تتغذى بالدم. تم جمع البعوض الفطري الذي يستريح في الداخل في المنازل بين الساعة 6.00 & # 160 صباحًا و 12.00 & # 160 مساءً في باهو (6 & # 17623 & # 8242 شمالًا ، 2 & # 17613 & # 8242E) ، والتي تقع بالقرب من ساحل المحيط الأطلسي في جنوب بنين ، غرب إفريقيا. تم إجراء العديد من المجموعات بين يوليو 2009 وأبريل 2011. تم إجراء مجموعة أخرى في Kpome (6 & # 17655 & # 8242N ، 2 & # 17619 & # 8242E) ، والتي تقع في الداخل على بعد حوالي 100 & # 160 كم من باهو ، في ديسمبر 2011. العينات الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة تم وصفها مسبقًا ، ويتم تقديم المراجع ذات الصلة عند ذكر العينات. تم إجراء جمع البعوض وتربيته كما هو موضح سابقًا 6 9. باختصار ، F1 تم تكوين البالغين من إناث بعوض تم جمعها ميدانيًا (باستخدام طريقة وضع البيض القسري 9) وتم خلطها عشوائيًا في أقفاص لإجراء تجارب لاحقة. تم تحديد جميع الإناث المستخدمة في وضع البيض الفردي من الناحية الشكلية والجزيئية على أنها An. funestus ss ، كما تم وصفه سابقًا 21.

تم إجراء فحوصات الحساسية للمبيدات باستخدام 4٪ DDT و 0.75٪ بيرميثرين باستخدام F من 2 إلى 5 أيام.1 البالغون من F المجمعة1 البعوض ، كما هو موضح سابقًا 21.

تم استخراج الحمض النووي الريبي من ثلاث دفعات من عشرة An. إناث الفطريات التي يتراوح عمرها من 2 إلى 5 & # 160 يومًا من مجموعتي العينات باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي Picopure (Arcturus ، Applied Biosystems ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، US) والمحلل الحيوي (Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على التوالي. تم تضخيم cRNA من كل عينة باستخدام مجموعة ملصقات Agilent Quick Amp (ثنائية اللون) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة & # 8217s. تم تصنيف cRNA من عينات Pahou المقاومة بصبغة cy5 بينما تم تصنيف السلالة الحساسة FANG (S) بصبغة cy3. تم تقييم كمية ونوعية cRNA قبل وضع العلامات باستخدام NanoDrop و Bioanalyzer. تم تهجين cRNAs المسمى إلى المصفوفات لمدة 17 و 160 ساعة عند 65 & # 176 درجة مئوية ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة & # 8217s. تم إجراء خمسة تهجين عن طريق مبادلة التكرارات البيولوجية.

تم تحليل بيانات Microarray باستخدام برنامج Genespring GX 12.0. لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا ، تم تطبيق قطع تغيير مزدوج ومستوى أهمية P & # 8201 & lt & # 82010.01 مع تصحيح Benjamin-Hochberg للاختبار المتعدد.

تم تقييم الجينات الأكثر ارتباطًا بالمقاومة من تحليل ميكروأري بواسطة qRT-PCR للتحقق من صحة نمط تعبيرها باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية لبعوض Pahou المقاوم (R) (على قيد الحياة بعد التعرض لـ 24 & # 160 ساعة لـ DDT) ، Pahou للتحكم في البعوض (C). ) (غير معرضة لأي مبيد حشري) و البعوض FANG (S). يتم سرد المواد الأولية في ملف إضافي 13: الجدول S5. بعد ذلك ، تم استخدام 1 & # 160 & # 956g إجمالي الحمض النووي الريبي من كل من التكرارات البيولوجية الثلاثة من بعوض Pahou المقاوم ، والتحكم Pahou وحساسية البعوض FANG كقالب لتخليق cDNA باستخدام Superscript III (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، US) مع oligo-dT20 و RNase H ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة & # 8217s. تم إجراء تضخيم qRT-PCR كما هو موضح سابقًا 5. تم حساب التعبير النسبي وتغير الطية لكل جين مستهدف في R و C بالنسبة إلى S وفقًا للطريقة 2 - & # 916 & # 916CT ، التي تتضمن كفاءة PCR 28 بعد التطبيع مع جينات التدبير المنزلي RSP7 (بروتين الريبوسوم S7 ، AGAP010592) والأكتين 5C (AGAP000651).

الملف الإضافي 13: الجدول S5

قائمة الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة.

التعبير المعدّل وراثيًا عن GSTe2 في ذبابة الفاكهة

بناء خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا

تم تضخيم جين GSTe2 كامل الطول من cDNA لبعوض بنين المقاوم باستخدام Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Fermentas ، Burlington ، Ontario ، Canada) والظروف التالية: 1 & # 160cycle عند 95 & # 176C لمدة 5 & # 160 دقيقة 35 & # 160 دراجة من 94 & # 176 درجة مئوية لمدة 20 & # 160 ثانية ، و 57 & # 176 درجة مئوية لمدة 30 & # 160 ثانية و 72 & # 176 درجة مئوية لمدة 60 و 160 ثانية ودورة 1 & # 160 عند 72 & # 176 درجة مئوية لمدة 5 & # 160 دقيقة. يتم سرد المواد الأولية المستخدمة في الملف الإضافي 13: الجدول S5. تمت تنقية منتجات PCR باستخدام QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم استنساخها في متجه الاستنساخ pJET1.2 / blunt باستخدام CloneJET TM PCR Cloning Kit (Fermentas ، Burlington ، أونتاريو ، كندا). تمت تنقية خمسة مستنسخات إيجابية من كلتا العينتين باستخدام مجموعة QIAprep & # 174 Miniprep (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم ترتيبها على كلا الخيوط. بعد تحليل التسلسل ، تم اختيار نسخة واحدة من GSTe2 التي كانت سائدة في بعوض بنين لبناء الذباب المعدل وراثيا. تمت إعادة تضخيم هذا الاستنساخ كما هو موضح أعلاه باستخدام مواد أولية تحتوي على مواقع تقييد لـ Bgl II و Xba I. تم هضم منتجات PCR المنقى باستخدام إنزيمات Bgl II و Xba I (Fermentas ، Burlington ، أونتاريو ، كندا) ، المستنسخة في ناقل pUASattB (مقدمة من الدكتور J Bischof ، جامعة زيورخ) ، تم هضمها مسبقًا بنفس إنزيمات التقييد وتحويلها إلى خلايا JM109 (Promega ، Madison ، Wi ، الولايات المتحدة). باستخدام نظام PhiC31 ، تم حقن الحيوانات المستنسخة في السلالة الجرثومية لـ D. melanogaster التي تحمل موقع الإرساء attP40 على الكروموسوم 2 (y 1 w 67c23 P (CaryP) attP40،12). تم إنشاء خط واحد معدل وراثيا ، UAS-GSTe2 ، ومتوازن. للتعبير عن التحوير GSTe2 ، تم الحصول على التعبير في كل مكان في الذباب باستخدام سلالة Act5C-GAL4 (y 1 w * P (Act5C-GAL4-w) E1 / CyO ، 12) (Bloomington Stock Center ، IN ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تأكيد التعبير GSTe2 في الذباب المعدل وراثيا بواسطة RT-PCR الكمي

لتأكيد التعبير عن GSTe2 في المجموعات التجريبية وغياب التعبير في المجموعات الضابطة ، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من ثلاث برك من خمسة ذباب. تم إجراء توليف (كدنا) كما هو موضح أعلاه. تم إجراء PCR باستخدام cDNA المركب كقالب وأشعال خاصة بـ GSTe2 (ملف إضافي 13: الجدول S5). بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم مستويات التعبير النسبي للجين التحوير GSTe2 بواسطة qRT-PCR في F1 ذرية تحت برنامج تشغيل Act5C وفي عناصر التحكم ذات الصلة مع التطبيع باستخدام جين التدبير المنزلي RPL11.

المقايسات الحيوية للتواصل مع ذبابة الفاكهة

إناث من ف1 تم اختيار معربا عن GSTe2 كمجموعة تجريبية للمقايسات الحيوية للمبيدات. تم استخدام السلالات الأبوية والنسل الأنثوي من التهجين بين الإناث والذكور Act5C-GAL4 الذين لم يحملوا الجين المحول GSTe2 (ولكن مع نفس خلفية attP40) كعناصر تحكم. تم استخدام مقارنة معدلات الوفيات بين المجموعات التجريبية والمجموعات الضابطة لتقييم ما إذا كان GSTe2 يمنح المقاومة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام إناث بعمر من 2 إلى 5 أيام بعد الخفقان في اختبار التلامس مع 4 ٪ DDT ومبيدات حشرية بيرثرويد بيرميثرين (2 ٪) ودلتاميثرين (0.15 ٪) ، كما هو موضح سابقًا 5. ثم تم وضع 20 إلى 25 ذبابة في كل قنينة ، وتم تسجيل معدل الوفيات بالإضافة إلى ضربة قاضية بعد 1 & # 160 ساعة ، 2 & # 160 ساعة ، 3 & # 160 ساعة ، 6 & # 160 ساعة ، 12 & # 160 ساعة و 24 & # 160 ساعة من التعرض للمبيد الحشري.لجميع الاختبارات ، تم إجراء ستة مكررات على الأقل. تم استخدام اختبار Student & # 8217s لمقارنة معدل الوفيات بالإضافة إلى الضربة القاضية في المجموعة التجريبية مع كل مجموعة تحكم.

تحليل تعدد الأشكال GSTe2 فيما يتعلق بمقاومة الـ دي.دي.تي

تحليل تعدد الأشكال (كدنا)

تم استنساخ (كدنا) كامل الطول الخاص بـ GSTe2 وتسلسله للبعوض المقاوم للـ دي.دي.تي من بنين ولـأن. funestus عبر إفريقيا (أوغندا وملاوي وموزمبيق وزامبيا) لاكتشاف الطفرات المحتملة التي يمكن أن ترتبط بمقاومة الـ دي.دي.تي. تم إجراء تضخيم (كدنا) باستخدام نفس (كدنا) المركب لـ qRT-PCR مع بوليميريز Phusion ، وتم استنساخ المنتج وتسلسله كما هو موضح أعلاه. يتم سرد المواد الأولية المستخدمة في الملف الإضافي 13: الجدول S5.

تحليل تعدد الأشكال بين بعوض الحقل الحساس والمقاوم في بنين

تم إجراء تقييم إضافي للعلاقة بين تعدد الأشكال لمقاومة GSTe2 و DDT عن طريق التضخيم الفردي والتسلسل المباشر للتسلسل الجينومي الكامل الطول لـ GSTe2 (جميع exons و introns) لستة بعوض حساس (ميت بعد التعرض لمدة 160 ساعة) و ستة بعوض مقاوم (على قيد الحياة بعد التعرض لمدة 1 و 160 ساعة) من Kpome لأنه لم يتم الحصول على بعوض حساس للإصابة في Pahou. تم الكشف عن المواقف متعددة الأشكال من خلال التحليل اليدوي لتتبعات التسلسل باستخدام BioEdit وكفروق تسلسلية في محاذاة متعددة باستخدام ClustalW 30. تم استخدام dnaSP 5.10 31 لتحديد مرحلة النمط الفرداني (من خلال خيار المرحلة) ولتقييم المعلمات الجينية ، مثل تنوع النيوكليوتيدات & # 960 ، وتنوع النمط الفرداني وتقديرات الاختيار D و D *. تم إنشاء شجرة احتمالية قصوى للأنماط الفردانية لكل من cDNA والتضخيم الجينومي باستخدام MEGA 5.2 32 ، وتم إنشاء شبكة النمط الفرداني باستخدام برنامج TCS 33 (حد اتصال 95 ٪ ، وتم التعامل مع الفجوات كحالة خامسة) لتقييم الاتصال المحتمل بين الأنماط الفردانية وأنماط المقاومة.

الفحص التشخيصي وتقييم ما إذا كان L119F يرتبط بمقاومة DDT

لتحديد التركيب الجيني لطفرة GSTe2 L119F في التجمعات الميدانية لـ An. funestus ، تم تصميم اختبار TaqMan المخصص بعد الفشل المتكرر من التسلسل الحراري بسبب العديد من نيوكليوتيدات الثايمين (Ts) حول موقع طفرة C / T. يتم توفير تسلسل التمهيدي والمراسل في ملف إضافي 14: الجدول S6. تم إجراء تفاعلات TaqMan في حجم نهائي 10 - & # 956 لتر يحتوي على 1 & # 215 SensiMix (Bioline ، لندن ، المملكة المتحدة) ، 800 نانومتر من كل تمهيدي و 200 نانومتر من كل مسبار باستخدام آلة Agilent MX3005P. تم استخدام ظروف ركوب الدراجات التالية: 10 & # 160 دقيقة عند 95 & # 176 درجة مئوية ، 40 & # 160 دراجة من 15 & # 160 ثانية عند 92 & # 176 درجة مئوية و 1 & # 160 دقيقة عند 60 & # 176 درجة مئوية. تم استخدام هذا الاختبار لتقييم العلاقة بين الأنماط الجينية لطفرة L119F والأنماط الظاهرية المقاومة للـ دي.دي.تي. بالنسبة لهذا الاختبار ، نظرًا لعدم وجود بعوض حساس من Pahou وقليل من البعوض الحساس من Kpome (في بنين) ، An. تم جمع عينات الفطريات في شمال الكاميرون من Gounougou (9 & # 17605 & # 8242N ، 13 & # 17640 & # 8242E) ، كما هو موضح أعلاه. تم إجراء اختبار أحيائي لمنظمة الصحة العالمية بشأن الـ دي.دي.تي على النحو الموصوف أعلاه. ثم تم توصيف 35 بعوضة ميتة بعد 1 & # 160 ساعة بنسبة 4٪ من التعرض للـ DDT (حساس) و 35 بعوضة حية (مقاومة) من Gounougou للطفرة L119F باستخدام مقايسة TaqMan.

الملف الإضافي 14: الجدول S6

الاشعال لمقايسة TaqMan L119F GSTe2.

ارتباط L119F بمقاومة البيرثرويد

لتقييم العلاقة بين الأنماط الجينية لطفرة L119F والأنماط الظاهرية المقاومة للبيرثرويد ، تم التنميط الجيني 25 بعوضة ماتت بعد 1 & # 160 ساعة من 0.75٪ بيرميثرين (النوع الأول بيريثرويد) التعرض (حساس) و 25 بعوضة حية (مقاومة) من جونوجو لطفرة L119F باستخدام مقايسة TaqMan. تم إجراء نفس التنميط الجيني لـ lambda-cyhalothrin (نوع II Pyrethroid). تم تقييم الارتباط بين أنماط المقاومة والأنماط الجينية من خلال تقدير نسب الأرجحية والأهمية الإحصائية بناءً على اختبار فيشر للاحتمال الدقيق 34.

مساهمة تنظيم GSTe2 وطفرة 119 & # 160F في النمط الظاهري للمقاومة

لتقييم ما إذا كان تنظيم GSTe2 ووجود طفرة 119 & # 160F ضروريان لمنح مقاومة DDT ، قمنا بمقارنة مستويات التعبير عن GSTe2 للأنماط الجينية الثلاثة لطفرة L119F جنبًا إلى جنب مع سلالة FANG الحساسة باستخدام qRT-PCR. تم استخدام ثلاث دفعات من خمس بعوض من Gounougou لعينات متماثلة الزيجوت (C / C L119 / L119) ، عينات متغايرة الزيجوت (C / T L119 / 119 & # 160F) وعينات مقاومة الزيجوت المتماثل (T / T 119 & # 160F / 119 & # 160F) باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه. تم إنشاء النمط الجيني لكل بعوضة لأول مرة بعد مقايسة TaqMan باستخدام gDNA (DNA الجينومي) المستخرج من الساقين ، ثم تم تجميع البعوض من نفس النمط الجيني لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) وتخليق (كدنا).

التوزيع الجغرافي لطفرة L119F عبر إفريقيا

لتقييم التوزيع الجغرافي لطفرة L119F عبر إفريقيا ، تم جمع 30 من النوع An. تم إجراء التنميط الجيني لإناث funestus ss من تسعة بلدان تنتمي إلى مناطق مختلفة من إفريقيا بواسطة TaqMan: بنين (Pahou ، تم جمعها في 2010 & # 82112011) ، غانا (Obuasi ، 2009) ، Burkina (Bobo-Dioualasso ، 2010) والكاميرون (Gounougou ، 2006) في غرب وسط إفريقيا ، أوغندا (تورورو ، 2009) وكينيا (كيسومو ، 2012) في شرق إفريقيا وملاوي (تشيكواوا ، 2009) ، زامبيا (مقاطعة كاتيتي ، 2011) وموزمبيق (تشوكوي ، 2009) في جنوب إفريقيا.

التركيبة السكانية لـ GSTe2 عبر إفريقيا. التجمعات الفطرية

لتقييم أنماط التباين الجيني لـ GSTe2 عبر مجموعات السكان الأفريقية في آن. funestus فيما يتعلق بمقاومة الـ دي.دي.تي وللكشف عن التوقيعات المحتملة للاختيار على هذا الجين ، تم تضخيم GSTe2 كامل الطول (exons و introns) وتسلسله مباشرة لـ 10 & # 821115 بعوضة أنثى تم جمعها ميدانيًا من ستة بلدان من مناطق مختلفة من إفريقيا. هذه الدول هي بنين وغانا والكاميرون في غرب وسط إفريقيا وأوغندا في شرق إفريقيا وموزمبيق وملاوي في جنوب إفريقيا. تم تحليل أنماط التباين الجيني كما هو موضح أعلاه باستخدام dnaSP 5.10 31. تم تقدير مستويات التمايز الجيني الزوجي بين السكان في dnaSP 5.10 باستخدام K. شارع الإحصائية 35 ، على الرغم من أن F شارع ون شارع كما تم الحصول على تقديرات للمقارنة. أهمية حرف K. شارع * تم تقييم التقديرات من خلال تبديل هويات السكان الفرعية وإعادة حساب K. شارع * 10000 مرة ، كما تم تنفيذه في dnaSP 5.10.

شجرة النشوء والتطور للأنماط الفردانية GSTe2

اختبار الاختيار على GSTe2

تعبير بروتين GSTe2 وتنقيته

تم استنساخ أليل GSTe2 المقاوم (119 & # 160F-GSTe2) من بنين (BN) واثنين من الأليلات الحساسة (L119-GSTe2) من أوغندا (UG) وملاوي (MAL) في بلازميد تعبير pET28a بين موقعي Nde I و Xho I العائد pET28a :: BN-GSTe2 و pET28a :: UG-GSTe2 و pET28a :: بنيات MAL-GSTe2. تم تحويل البلازميدات pET28a :: BN-GSTe2 و pET28a :: UG-GSTe2 و pET28a :: MAL-GSTe2 إلى سلالة Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة) للتعبير عن البروتين باستخدام البروتوكولات القياسية. تمت زراعة ما مجموعه 5 & # 160 مل من الثقافة الليلية في 500 & # 160 مل من مرق 2TY الطازج بالإضافة إلى كاناميسين (50 & # 160 & # 956 جم / مل). نمت الخلايا المحولة عند 37 & # 176 درجة مئوية. تم إحداث تعبير GSTe2 بعد ذلك باستخدام 0.3 & # 160mM من الأيزوبروبيل - & # 946-D-thiogalactoside عندما كان OD (الكثافة الضوئية) عند 600 & # 160 نانومتر 0.6 إلى 0.8 بين عشية وضحاها عند 16 & # 176 درجة مئوية. تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي (15 & # 160 دقيقة ، 4500 & # 8201 جم) معلق في 25 & # 160 ملم TrisHCl pH & # 1608.0 ، 500 & # 160mM NaCl ، 20 & # 160mM imidazole و 5 & # 160mM & # 946-mercaptoethanol وتعطله صوتنة. بعد الطرد المركزي (40 & # 160 دقيقة ، 40،000 & # 8201 جم) ، تمت تصفية المادة الطافية الصافية ، وتمت تنقية GSTe2s التي تحمل علاماته باستخدام Ni-NTA agarose (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة & # 8217s. تم خلط المادة الطافية المفلترة مع الخرزات التي تمت معايرتها مسبقًا. بعد الحضانة ، تم إجراء خطوة غسيل بعشرة مجلدات من 25 & # 160mM TrisHCl pH & # 1608.0 و 500 & # 160mM NaCl و 20 & # 160mM imidazole و 5 & # 160mM & # 946-mercaptoethanol buffer. أنتجت جميع التركيبات منتجات 26.8 & # 160kDa. بعد غسيل الكلى الكامل مقابل 25 & # 160mM TrisHCl pH & # 1608.0 و 200 & # 160mM NaCl و 5 & # 160mM & # 946-mercaptoethanol ، تم قطع علامة His-tag باستخدام 7.5 وحدة من الثرومبين لكل مجم من البروتين الموسوم. تم إجراء خطوة تنقية نهائية باستخدام عمود Superdex 200 16/60 (Amersham Biosciences Limited ، لندن ، المملكة المتحدة) للحصول على عينة عالية النقاء (الشكل رقم 160 5 أ). تمت مراقبة الدورات الزمنية للكروماتوغرافيا بواسطة SDS-PAGE (الشكل رقم 160 5 ب). تم تركيز بروتينات GSTe2 إلى 23 و # 160 ملغ / مل مع مُركّز بروتين أميكون بقطع 10 كيلو دالتون (YM-10 Millipore Corporation ، Bedford ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد تركيز البروتين النهائي بطريقة طيفية باستخدام معامل الامتصاص المولي المحسوب عند 280 & # 160 نانومتر. تم حفظ العينات في 4 & # 176 درجة مئوية.

المقايسة الأيضية لتقييم تأثير GSTe2 على الـ دي.دي.تي ، البيرميثرين والدلتاميثرين

تم تحديد نشاط GST بمقايسة طيفية لفحص تكوين اتحاد 1-chloro-2،4-dinitrobenzene (CDNB) وخفض GSH. تُعرَّف وحدة الإنزيم بأنها كمية الإنزيم التي تنتج 1.0 & # 160 & # 956 مول من المنتج المتقارن في الدقيقة عند درجة الحموضة & # 1606.5 و 30 & # 176 درجة مئوية. تم إجراء فحوصات الأيض عند 30 & # 176 درجة مئوية لمدة 60 و 160 دقيقة مع اهتزاز عند 1200 & # 160 دورة في الدقيقة ، بحجم إجمالي يبلغ 0.5 & # 160 مل. كان نظام العازلة 0.1 & # 160M عازلة فوسفات البوتاسيوم (pH & # 1606.5) ، 2.5 & # 160mM GSH و 0.2 وحدة من الإنزيم في وجود 10 & # 160 & # 956g / ml DDT ، 0.025 & # 160mg / ml بيرميثرين أو 0.03 & # 160 مجم / مل من الدلتاميثرين كله في ميثانول (لا يتجاوز المذيب 10٪ من الحجم الكلي للتفاعل). احتوت عينة التحكم على نفس خليط الكاشف مع الإنزيم المؤتلف المغلي. بعد 1 & # 160 ساعة من الحضانة ، تمت إضافة 500 & # 160 & # 956 لتر من الميثانول لإيقاف التفاعل ثم تم طرد العينات عند 13000 & # 160 دورة في الدقيقة لمدة 20 و 160 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة وتم نقل 200 & # 160 & # 956 لتر من المادة الطافية الناتجة لقوارير HPLC. تم تحديد كمية DDT و DDE و pyrethroid المتبقية في العينات عن طريق HPLC ذو المرحلة العكسية مع مراقبة طول موجة الامتصاص من 232 & # 160 نانومتر (Chromeleon ، Dionex ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة). باختصار ، تم حقن 100 & # 160 & # 956l من العينة في عمود 250 & # 160 مم C18 (Acclaim 120 ، Dionex ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة) عند 23 & # 176 درجة مئوية. تم تحقيق فصل الـ DDT و DDE باستخدام طور متحرك متساوي من 92٪ ميثانول و 8٪ ماء بمعدل تدفق 1 & # 160 مل / دقيقة. أجريت الدراسات الحركية كما هو موضح سابقًا 8. تم تحليل النتائج عن طريق الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software ، Inc ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

استقلاب GSTe2 الإضافي للبيرميثرين عن طريق التدرج التدريجي

لحل قمم المستقلب الملحوظة بشكل أفضل للبيرميثرين مع التشغيل المتساوي الأولي ، تم إجراء تحليل إضافي لملف التمثيل الغذائي للبيرميثرين بواسطة GSTe2 باستخدام حالة تشغيل متدرجة. تم فصل المركب الرئيسي ومستقلباته على عمود تهليل C18 عن طريق حقن 100 & # 160 & # 956 لتر من منتجات التفاعل المعاد تكوينها في ميثانول 1 & # 160 مل بعد خطوة استخلاص أسيتات الإيثيل والتبخر. كان خليط التفاعل 2 & # 160 مل مع 10 & # 160 & # 956 جم / مل بيرميثرين و 0.2 وحدة من GSTe2. بدأ التفاعل بإضافة 2.5 & # 160mM GSH. تم استخدام خليط حضانة مصل البقر كعنصر تحكم سلبي. كانت الأطوار المتنقلة المستخدمة هي المذيب أسيتونيتريل (أ) ، والميثانول (ب) ، وح2يا (ج). تمت إزالة التحليلات باستخدام برامج التدرج التالية (زيادة خطية): 0 & # 160 دقيقة (0٪ أ ، 5٪ ب ، 95٪ ج) ، 15 & # 160 دقيقة (37٪ أ ، 5٪ ب ، 58٪ ج) ، 25 & # 160 دقيقة (60٪ أ ، 5٪ ب ، 35٪ ج) ، 50 & # 160 دقيقة (85٪ أ ، 5٪ ب ، 10٪ ج) ، 51 & # 160 دقيقة (95٪ أ ، 5٪ ب ، 0٪ ج) ، 56 & # 160 دقيقة (95٪ أ ، 5٪ ب ، 0٪ ج) ، 61 & # 160 دقيقة (0٪ أ ، 5٪ ب ، 95٪ ج) و 69 & # 160 دقيقة (0٪ أ ، 5٪ ب ، 95٪ ج) ، بمعدل تدفق 1 & # 160 مل / دقيقة. تم الكشف عن القمم عند 232 & # 160 نانومتر. تم جمع البيانات وتحليلها باستخدام برنامج Chromeleon.

تحديد هيكل GSTe2 وتحام أليلات الـ دي.دي.تي

تمت تنقية GSTe2 من بعوض بنين وأوغندا وملاوي كما هو موصوف في المعلومات التكميلية لفحوصات التمثيل الغذائي. تم التحقيق في ظروف التبلور الأولية لـ GSTe2 من خلال تقنيات عالية الإنتاجية باستخدام روبوت NanoDrop (Innovadyne Technologies Inc. ، سانتا روزا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) باستخدام حلول الشاشة التجارية Crystal Screen 1 و 2 (Hampton Research، Aliso Viejo، CA، US) و PACT Suite و JCSG Suite (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). تم إجراء فحوصات التبلور باستخدام طريقة انتشار البخار بالجلوس عند 18 & # 176 درجة مئوية في 96 طبقًا جيدًا (الألواح الدقيقة Innovaplate SD-2 ، Innovadyne Technologies Inc. ، سانتا روزا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). تم خلط قطرات من 250 & # 160 nl بروتين عند 23 & # 160mg / ml و 250 & # 160 nl محلول الترسيب ومعايرتها مقابل 65 & # 160 & # 956l من محلول البئر. أدت ظروف التبلور الأولية إلى مجموعات بلورية من الصفائح الرقيقة. تم استخدام العديد من الاستراتيجيات لتحسين أفضل ظروف التبلور ، والتي تضمنت تعديل تكوين عينة البروتين ، وتركيز المادة المترسبة وقيم الأس الهيدروجيني ، والفرز باستخدام إضافات مختلفة (شاشة مضافة ، أبحاث هامبتون ، أليسو فيجو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) أو المنظفات. تم توسيع الظروف النهائية على 24 لوحًا جيدًا (لوحات Linbro ، Hampton Research ، Aliso Viejo ، CA ، الولايات المتحدة) من خلال تجارب الإسقاط المعلق وعلى 60 بئرًا تحت الزيت (لوحات Terasaki) عند 18 & # 176 درجة مئوية.

نمت البلورات المستخدمة في تحليلنا من مزيج من 1 & # 160 & # 956l من محلول البروتين عند 23 & # 160mg / ml و 2 & # 160 & # 956l من محلول الترسيب. بعد صقل العديد من المعلمات ، تم الحصول على بلورات موشورية وقضيبية معزولة. تمت تبلور BN-GSTe2 عن طريق نشر بخار معلق باستخدام محلول كمرسب يحتوي على 40٪ (حجم / حجم) PEG 300 و 0.1 & # 160M فوسفات سيترات pH & # 1604.2. ومع ذلك ، تمت بلورة UG-GSTe2 و MAL-GSTe2 باستخدام microbatch تحت تقنية الزيت مع مادة ترسب 25٪ & # 160w / v PEG 1500 و 0.1 & # 160M PCB (بروبيونات ، كاكوديلات ، Bis-Tris Propane) عازلة pH & # 1606.0 ، و 25٪ & # 160w / v PEG 1500 و 0.1 & # 160M MMT (L-Malic acid، MES، Tris) عازلة pH & # 1605.0 ، على التوالي. لتنمية بلورات holo_GSTe2 ، تمت إضافة 0.5 & # 160 & # 956l من 10 & # 160mM GSH (L-glutathione مخفض) / GSSG (L- الجلوتاثيون المؤكسد) من Hampton Research إلى قطرات التبلور. تم اختبار العديد من المواد الواقية من التجمد ، بما في ذلك الجلسرين ، MPD (2-ميثيل-2،4-بنتانيديول) والبولي إيثيلين جلايكول. كان أفضل محلول واق من البرودة هو 20٪ جلسرين على الخمور البلورية.

جمع البيانات وتحليل الهيكل

تم تركيب البلورات على حلقة ليفية ، ونقلها إلى محلول الحماية من التجمد وتم تجميدها بسرعة 100 و # 160 كلفن في بخار غاز النيتروجين. تم جمع بيانات الحيود الأولية باستخدام كاشف لوحة التصوير Mar345dtb (MarResearch ، Norderstedt ، ألمانيا) باستخدام Cu Kα تعمل الأشعة السينية الناتجة عن مولد الأنود الدوار (MicroStar ، Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة) مع مرايا هيليوس (Bruker ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة) عند 45 & # 160kV و 60 & # 160mA. لم تكن بلورات apo_UG-GSTe2 و holo_MAL-GSTe2 مناسبة لتحليل بيانات الأشعة السينية لأن حيودها كان ضعيفًا للغاية. ومع ذلك ، كان لبلورات apo_BN-GSTe2 و holo_BN-GSTe2 و holo_UG-GSTe2 أنماط حيود جيدة. تم جمع مجموعة بيانات الحيود الكاملة لكل منها باستخدام مرفق الإشعاع السنكروتروني الأوروبي (غرونوبل ، فرنسا) (انظر التفاصيل في الملف الإضافي 15: الجدول S7). تمت معالجة بيانات الانعراج باستخدام XDS (برنامج كاشف الأشعة السينية) 38 وقياسها باستخدام SCALA من حزمة CCP4 (مشروع حسابي تعاوني ، رقم 4 ، 1994). تم استخدام الاستبدال الجزيئي ببرنامج Phaser 39 لحل هياكل GSTe2. الإحداثيات من An. تم استخدام gambiae glutathione S-transferase epsilon 2 (agGSTe2) [PDB: 2IL3] (92٪ هوية تسلسل 27) لحل الهياكل apo_BN-GSTe2 و holo_UG-GSTe2. تم حل بنية holo_BN-GSTe2 باستخدام إحداثيات holo_UG-GSTe2. كانت هناك حاجة لعدة دورات من التحسين المقيّد باستخدام PHENIX 40 وبناء النموذج التكراري باستخدام COOT للحصول على النماذج النهائية. كما تم نمذجة جزيئات الماء. يتم تلخيص جمع البيانات ومعالجتها وإحصاءات تحسين النموذج في ملف إضافي 15: الجدول S7.

الملف الإضافي 15: الجدول S7

إحصاءات موجزة لجمع البيانات ومعالجتها وصقل النموذج.

تم التحقق من الكيمياء المجسمة للنماذج باستخدام MolProbity ، وتم إنتاج أشكال النماذج الجزيئية باستخدام PyMol (نظام الرسومات الجزيئية PyMOL ، الإصدار 1.5.0.4 Schr & # 246dinger ، LLC ، Portland ، OR ، US). تم حساب RMSDs بين هياكل البروتينات في COOT. تم استخدام خوارزمية DALI لمحاذاة التسلسل القائم على الهيكل لـ BN-GSTe2 و UG-GSTe2 مع ضريبة السلع والخدمات الأخرى للحشرات.

تم إجراء إرساء مادة DDT على أليلات مختلفة من GSTe2 باستخدام برنامج التحسين الجيني لرسو السفن Ligand (GOLD) من مركز بيانات التصوير البلوري في كامبريدج ، المملكة المتحدة. تم استخدام كل من DDT ​​و DDE في حسابات الإرساء. تم الحصول على الهياكل ثلاثية الأبعاد لهذه الجزيئات من قاعدة بيانات كامبريدج الهيكلية برموز مرجعية CPTCEL و DCLPEY ، على التوالي. تم تأكيد الكيمياء الفراغية للروابط من خلال برنامج Mercury. تم استخدام إحداثيات holo_BN-GSTe2 و holo_UG-GSTe2 لتحديد موقع الربط لدراسات الالتحام الجزيئي. تمت إزالة جميع جزيئات المذيب في الهياكل ، وأضيفت ذرات الهيدروجين إلى البروتين بأكمله. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة ذرات الهيدروجين إلى جزيء العامل المساعد وتم نزع مجموعة سيستين SH للحصول على GS & # 8722 لحسابات الالتحام. تم تعريف تجويف الالتحام على أنه مجموعة من الأحماض الأمينية المحاطة داخل كرة بنصف قطر 10 & # 160 & # 197 حول جزيء GS & # 8722 ، مما يمنح حرية الحركة لـ F118 أو R112 أو E116 أو L119 أو F119 أو F120 أو T165 و L207 والمزيد من المرونة المقيدة إلى M111 و F115 في دوارات السلسلة الجانبية. تم استخدام الإعدادات الافتراضية القياسية في جميع العمليات الحسابية (عدد الإرساء: 10) ، ولكن تم السماح بالإنهاء المبكر عندما كانت الحلول الثلاثة الأولى ضمن 1.5 & # 160 & # 197 RMSD من بعضها البعض.

تم إيداع تسلسلات الحمض النووي الواردة في هذه الورقة في قاعدة بيانات GenBank [GenBank: KC800340-GenBank: KC800421] ، وبيانات المصفوفة الدقيقة في ArrayExpress (E-MTAB-1578) وهياكل الأشعة السينية ثلاثية الأبعاد في قاعدة بيانات PDB (BN- GSTe2-GSH [PDB: 3zmk] و UG-GSTe2-GSH [PDB: 3zml]).

BN: Benin bp: الزوج الأساسي CAM: Cameroon cRNA: التكميلي RNA DDT: ثنائي كلورو ثنائي الفينيل ثلاثي كلورو الإيثان FC: أضعاف التغيير GH: غانا GSH: الجلوتاثيون GST: الجلوتاثيون S-ترانسفيراز HD: التنوع أحادي الصيغة الصبغية HKA: اختبار هدسون وكريتمان وأجواد IRS: بقايا داخلية الرش kb: kilobase kdr: مقاومة ضربة قاضية LLIN: شبكة مبيدات حشرية طويلة الأمد MAL: ملاوي MK: اختبار McDonald and Kreitman MOZ: Mozambique PCR: تفاعل البوليميراز المتسلسل PDB: بنك بيانات البروتين PEG: بولي (إيثيلين) جلايكول qRT-PCR: النسخ العكسي الكمي تفاعل البوليميراز المتسلسل RDL: مقاومة الديلدرين RMSD: انحراف الجذر التربيعي المتوسط ​​UG: أوغندا UTR: منطقة غير مترجمة منظمة الصحة العالمية: منظمة الصحة العالمية.

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

CSW تصور وتصميم وتنسيق البحث. قام كل من RD و BDM و CSW بجمع العينات والمقايسات الحيوية. أجرى HI و CSW تحليلات النسخ ونفذا تحليل التباين الجيني. أجرى JMR التعبير المعدّل وراثيًا في ذبابة الفاكهة. أجرى CY الدراسة البلورية باستخدام AA. أجرى HMI و SSI و JMR فحوصات التمثيل الغذائي لـ GSTe2. ساهمت الموارد البشرية و JH في تحليل البيانات والرؤى المهمة. كتب JMR و CY و HMI و CSW المخطوطة بمساهمة من جميع المؤلفين. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.

تم دعم هذا العمل من خلال زمالة Wellcome Trust RCD (083515 / Z / 07 / Z) إلى CSW. تم دعم JMR من قبل Fundaci & # 243n Ram & # 243n Aceres زمالة. ساهمت منحتان (BFU2011-25384 / CSD2006-00015) إلى AA في دراسة علم البلورات. نشكر مارك باين على رؤيته وتعليقاته.

مقاومة الحشرات الناقلة للأمراض التي تصيب الإنسان

شريحة إزالة السموم من Anopheles gambiae: مصفوفة دقيقة دقيقة للغاية لدراسة مقاومة المبيدات الحشرية الأيضية في نواقل الملاريا

تُفرط الأنوفيلة الغامبية المقاومة للبيرميثرين في الحقل في التعبير عن CYP6P3 ، وهو P450 الذي يستقلب البيريثرويدات

تؤدي أليلات السيتوكروم P450 المختارة بشكل مباشر إلى انتشار مقاومة البيرثرويد في ناقلات الملاريا الرئيسية Anopheles funestus

استكشاف آليات المقاومة المتعددة للمبيدات الحشرية في مجموعة من ناقلات الملاريا Anopheles funestus في بنين

تحديد فئة جديدة من نقل الجلوتاثيون S للحشرات المتورطة في مقاومة مادة الـ دي.دي.تي في ناقلات الملاريا Anopheles gambiae

دور Aedes aegypti epsilon glutathione transferase في منح مقاومة لمبيدات الحشرات DDT والبيروثرويد

مقاومة البيرثرويد في مجموعة Anopheles funestus من أوغندا

مقاومة مبيدات الحشرات وارتباطها بطفرات الموقع المستهدف في التجمعات الطبيعية للأنوفيلة الغامبية من شرق أوغندا

النمذجة الجزيئية المقارنة للأنوفيلة الغامبية CYP6Z1 ، بعوضة P450 قادرة على استقلاب مادة الـ دي.

تحديد والتحقق من صحة الجين الذي يسبب المقاومة المتصالبة بين فئات المبيدات الحشرية في Anopheles غامبيا من غانا

تقييم إمكانات مقاومة المبيدات الحشرية لثمانية جينات ذبابة الفاكهة melanogaster السيتوكروم P450 عن طريق التعبير الجيني المفرط

الجلوتاثيون S- ترانسفيراز في الدفاع ضد البيريثرويدات في الحشرات

إن ترانسازات الجلوتاثيون إس كعوامل دفاعية مضادة للأكسدة تمنح مقاومة البيرثرويد في نيلابارفاتا لوجنز

أليل p450 واحد مرتبط بمقاومة مبيدات الحشرات في ذبابة الفاكهة

بديلان مختلفان للأحماض الأمينية في Ali-esterase ، E3 ، يمنحان أنواعًا بديلة من مقاومة مبيدات الحشرات العضوية الفوسفورية في ذبابة الخراف ، Lucilia cuprina

نفس استبدال الأحماض الأمينية في الإسترات المتعامدة يمنح مقاومة الفوسفات العضوي على ذبابة المنزل وذبابة النفخ

توصيف مقاومة DDT والبيرثرويد والكربامات في Anopheles funestus من Obuasi ، غانا

تحديد وتوزيع طفرة مستقبلات GABA تمنح مقاومة الديلدرين في ناقلات الملاريا Anopheles funestus في إفريقيا

ارتفاع مستوى مقاومة البيرثرويد في مجموعة Anopheles funestus في منطقة Chokwe في موزمبيق

تأثير مقاومة البيريثرويد على المكافحة التشغيلية للملاريا في ملاوي

تطوير ركائز الفلورسنت الشبيهة بالبيرثرويد للجلوتاثيون S-ترانسفيراز

رؤى الجينوم في الاختيار الإيجابي

مسح انتقائي قوي مرتبط بإدخال ترانسبوسون في ذبابة الفاكهة

التركيب الجيني للسكان على نطاق واسع لناقل الملاريا الأفريقي Anopheles funestus

يوفر هيكل فئة الجلوتاثيون S-transferase من فئة إبسيلون الحشرات من ناقل الملاريا Anopheles gambiae تفسيراً لنشاط إزالة السموم المرتفع من مادة الـ دي.دي.تي

تحليل بيانات PCR في الوقت الحقيقي بطريقة المقارنة C (T)

استغلال تأثيرات الموقع وعوازل الفيروسات القهقرية الغجرية لهندسة الجينات المعبر عنها بدقة

CLUSTAL W: تحسين حساسية المحاذاة التدريجية المتعددة التسلسل من خلال ترجيح التسلسل ، وعقوبات الفجوة الخاصة بالموضع واختيار مصفوفة الوزن

تحليل تعدد أشكال تسلسل الحمض النووي باستخدام DnaSP

MEGA5: تحليل الجينات التطورية الجزيئية باستخدام أقصى احتمالية ، والمسافة التطورية ، وأساليب البخل القصوى

TCS: برنامج كمبيوتر لتقدير الأنساب الجينية

تشريح الآليات المسؤولة عن النمط الظاهري للمقاومة المتعددة للمبيدات الحشرية في Anopheles gambiae s.s. ، شكل M ، من فالي دو كو ، بوركينا فاسو

تقدير مستويات تدفق الجينات من بيانات تسلسل الحمض النووي

KaKs_calculator: حساب Ka و Ks من خلال اختيار النموذج ومتوسط ​​النموذج

طرق بسيطة لتقدير عدد بدائل النوكليوتيدات المترادفة وغير المترادفة


الاستجابة الالتهابية

عندما تتلف الخلايا أو تتلف ، يتم بدء سلسلة من الأحداث الوعائية والخلوية المعروفة باسم الاستجابة الالتهابية. هذه الاستجابة تحمي الصحة من حيث أنها تدمر أو تحجب التأثيرات الضارة وتمهد الطريق لاستعادة الحياة الطبيعية. تسلسل الأحداث على النحو التالي: في منطقة الإصابة (كما في العدوى البكتيرية) ، تطلق الخلايا مواد تتسبب في توسع الأوعية الدموية الصغيرة في المنطقة المصابة (توسع الأوعية) وبالتالي زيادة تدفق الدم إلى المنطقة المصابة في الوقت نفسه ، يتسرب السائل الصافي من الأوعية إلى المنطقة التي يميل هذا السائل إلى تخفيف أي مواد ضارة في منطقة الإصابة بعد ذلك ، وتتدفق الخلايا البيضاء من الأوعية الدموية إلى المنطقة المتضررة وتبلعم البكتيريا و الخلايا الميتة يعرف الخليط الناتج من الحطام الخلوي الميت وخلايا الدم البيضاء بالصديد.

العلامات الرئيسية للالتهاب هي الاحمرار وزيادة الحرارة (بسبب تمدد الأوعية الدموية) والتورم (الناتج عن تراكم السوائل) والألم. آخر هذه العلامات هي إحدى العلامات الأساسية لجميع الاستجابات الالتهابية. يحدث الألم في الالتهاب بسبب المواد التي تطلقها الأنسجة التالفة والتي تجعل النهايات العصبية المحلية أكثر حساسية للتحفيز. يمكن تصنيف الالتهاب على أنه حاد أو مزمن. يستمر الالتهاب الحاد ، مثل الذي يمكن رؤيته حول جرح الجلد ، لبضعة أيام فقط ويتميز مجهريًا بوجود كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال. الالتهاب المزمن طويل الأمد ويتميز مجهريًا بوجود الخلايا الليمفاوية والوحيدة وخلايا البلازما ، وبشكل عام يرتبط بقليل من إفراز السوائل.

نظرًا للألم والتورم ، غالبًا ما يُنظر إلى الاستجابة الالتهابية على أنها حدث غير مرحب به بعد الإصابة. ومع ذلك ، من المهم أن ندرك أنها الخطوة الأولى في عملية الشفاء وتمثل استجابة وقائية مهمة في الحفاظ على الصحة.


شاهد الفيديو: المحاضرة التاسعة. الايض الخلوي-التنفس-التحلل السكري-التنفس اللاهوائي. الفصل الأول (شهر فبراير 2023).