معلومة

استنساخ متعدد سانجر تحليل التسلسل

استنساخ متعدد سانجر تحليل التسلسل


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم باستنساخ 96 مصفوفة جيدًا. لقد قمت بعمل Gibson ، والتحويلات ، و minipreps بتنسيق 96 جيدًا ، ثم أرسلت اللوحة للتسلسل. عادةً ، أقوم بتسلسل 3-4 نسخ وأتحقق مما إذا كان التسلسل يبدو جيدًا يدويًا باستخدام Benchling لأنه يحتوي على أداة تصور رائعة تبرز عدم التطابق ولكنها تعرض أيضًا جودة التسلسل. الآن يجب أن أتحقق من تسلسل 96 نسخة فردية. من الواضح أنه يمكنني كتابة نص بسيط يقوم بإجراء المحاذاة والإبلاغ عن جودة المحاذاة. ومع ذلك ، أعتقد أنه يجب أن تكون هناك بالفعل أدوات متاحة تعمل مع تسلسل Sanger clonal وتوفر تصورًا رائعًا للعديد من المحاذاة في وقت واحد. أي توصيات لأدوات محددة يجب علي استخدامها؟ شكرا لك!


لم أستخدمه شخصيًا ولكن يبدو أن seqtrace مستهدف لهذا الغرض. يبدو أنه قادر على القيام بالمحاذاة ويسهل تحليل ملف التتبع المتعدد.

أنا قلق قليلاً بشأن عدم فحص ملفات التتبع بصريًا لتسلسل الحيوانات المستنسخة ، لكن قد أكون ديناصورًا نسبيًا (على الأقل على الأقل خطر).

هنا هو الملخص:

غالبًا ما تتطلب التطبيقات الحديثة لتسلسل Sanger DNA تحويل عدد كبير من ملفات تتبع الكروماتوجرام إلى تسلسلات DNA عالية الجودة لتحليلات المصب. يتوفر عدد قليل نسبيًا من أدوات البرامج غير المسجلة الملكية للمساعدة في هذه العملية. SeqTrace هو تطبيق برمجي جديد ومجاني ومفتوح المصدر تم تصميمه لأتمتة سير العمل بالكامل تسهيل معالجة الدُفعات السهلة لعدد كبير من ملفات التتبع. يمكن لـ SeqTrace تحديد ومحاذاة وحساب تسلسلات الإجماع من مطابقة التعقبات الأمامية والعكسية ، وتصفية المكالمات الأساسية منخفضة الجودة ، والتسلسلات النهائية للقطع النهائي. ميزات البرنامج أ واجهة رسومية تتضمن عارض كروماتوجرام كامل الميزات ومحرر التسلسل. يعمل SeqTrace على أنظمة التشغيل الأكثر شيوعًا وهو متاح مجانًا ، إلى جانب الوثائق الداعمة ، على http: // seqtrace. © 2012 ABRF.


أتوقع أن تكون هذه نصيحة يعرفها الجميع ، ولكن يمكن تخفيف BigDye بشكل كبير ومع ذلك تعطي نتائج جيدة. هناك العديد من المنشورات التي تصف طرقًا للقيام بذلك وهناك مزوِّدون تجاريون لمخازن تخفيف BigDye.

لا تحتاج إلى تحضير البلازميد للنسخ الخاصة بك لتسلسل سانجر. بعد اختيار الحيوانات المستنسخة للثقافة ، قم ببساطة بتدوير الكوكتيل الخاص بك والتمسك بمزيج رئيسي من PCR مع مواد أولية لموقع الاستنساخ المتعدد الخاص بك (ربما M13 F & ampR). أرسل تقرير PCR لتسلسل Sanger ويمكنك الحصول على النتائج في اليوم التالي. ستحتاج بعد ذلك فقط إلى الإعداد المتوسط ​​للنسخ التي تحتاجها حقًا لمواصلة مشروعك.


التسلسل المباشر لمنتجات PCR

من الممكن تمامًا إجراء تسلسل مباشر لمنتج PCR دون استنساخ الجزء أولاً. في الواقع ، هناك بعض المزايا المميزة لهذا النهج. ومع ذلك ، يجب أن تكون على دراية ببعض العيوب أيضًا. نادرًا ما يكون تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر ناجحًا ما لم تقضي بعض الوقت في التأكد من عدم الوقوع في أحد الفخاخ العديدة. سيشرح هذا المستند كيفية الحصول على التسلسل مباشرة من منتج PCR مع فرصة معقولة للنجاح.

تأكد من تضخيم الجزء الصحيح.
ستندهش من عدد المرات التي ينتج فيها تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإنتاج النطاق الصحيح ، في حين أنه في الواقع يضخم شيئًا زائفًا. في بعض الأحيان عندما تقوم بتسلسل الفرقة ، ستكتشف أن التسلسل غير متوقع تمامًا وغير منطقي. في أوقات أخرى ، سيعطي التسلسل باستخدام أحد بادئات PCR حارة فارغة تمامًا ، بينما سيعطي التمهيدي الآخر تسلسلين متزامنين ومتراكبين (وبالتالي غير قابلين للقراءة). يحدث ذلك عندما يتصرف أحد البادئات الخاصة بك كطرفين * لتضخيم غير شرعي.
تأكد من أنك تقوم بالفعل بتضخيم الجزء الذي توقعته. على سبيل المثال ، إذا كنت تعرف موقع تقييد في الجزء ، فحاول قصه وابحث عن نطاقات المنتج الصحيحة. بدلاً من ذلك ، استخدم مواد أولية متداخلة لإعادة تضخيم المنتج المطلوب للتحقق من هويته والقضاء بالصدفة على أي منتجات غير مشروعة.

يجب عليك إزالة جميع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتبقية والنيوكليوتيدات غير المدمجة.
يستخدم التسلسل أساسًا واحدًا ، بينما يستخدم PCR اثنين. إذا حاولنا التسلسل مع وجود اثنين من البادئات ، فستستعيد التسلسلتين ، متراكبتين على بعضهما البعض وغير قابلة للقراءة تمامًا.
هناك العديد من الطرق لتنقية تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل تسلسله. يصنع العديد من الشركات المصنعة مجموعات للقيام بهذه المهمة. نحن نفضل عدم التوصية بمنتجات معينة ، ولكن اطلب من جيرانك نصيحتهم. يقوم بعض الأشخاص فقط بإزالة شريط PCR ، والذي لا يزيل فقط البادئات والنيوكليوتيدات الدخيلة بل يزيل أيضًا منتجات PCR غير المشروعة (انظر أدناه).

إذا كانت البادئات PCR هي أيضًا التمهيدي التسلسلي ، فتأكد من مطابقتها لظروفنا.
قد تكون قادرًا على ضبط شروط PCR لتحسين ردود الفعل ، لكننا ، للأسف ، لا يمكننا القيام بذلك. يرجى التأكد من أن التمهيدي (البرايمر) مصمم بشكل مناسب للتسلسل الآلي. يجب أن يكون لديهم Tm بين 60 و 70 درجة (أو على الأقل بين 55 و 75 في الخارج) ويجب أن يكون لديهم ميل قليل لتشكيل ثنائي التمهيدي. انقر هنا للحصول على معلومات كاملة عن التصميم التمهيدي لتسلسل الحمض النووي.

لا تفرط في تركيز العينة! تحقق مرة أخرى من القالب التركيزات.
تكون أجزاء PCR أصغر ، وبالتالي تكون قوالب التسلسل أكثر فاعلية وهي البلازميدات المعتادة. وبالتالي ، لا يحتاجون إلى تركيز عالٍ. على سبيل المثال ، يجب أن يكون جزء 200 نقطة أساس فقط هو 1 نانوغرام / ul! إذا كانت عيناتك ذات تركيز عالٍ جدًا ، فلن يقتصر الأمر على عدم تسلسلها بشكل أفضل فحسب ، بل قد تتسبب في مشاكل لأشخاص آخرين & # 8217 عينات قريبة. يرجى تقدير تركيزات منتج PCR الخاص بك على هلام تحليلي ، وتخفيفها وفقًا للتوصيات.

أحيانًا تكون البادئات غير الفعالة مناسبة لـ PCR ، لكن نفس البادئات قد تفشل في التسلسل.
نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو في جوهره عملية أسية ، ولأنه عادةً ما يتم تنفيذه إلى ما بعد الانتهاء ، فحتى البادئات الضعيفة ستنتج تضخيمًا في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). التسلسل. ومع ذلك ، فهو خطي بشكل صارم ، وهو لا يرحم أكثر من البادئات السيئة. إذا كان عليك أن تقوم بالدورة أكثر من 35 مرة أو نحو ذلك للحصول على منتج تضخيم ، أو إذا كان عليك استخدام إضافات غير عادية أو ظروف غريبة لتحقيق النجاح ، فقد لا يكون التمهيدي الخاص بك فعالًا بما يكفي لاستخدامه في التسلسل.
إذا كان التمهيدي الخاص بك غير متطابق مع القالب * الأصلي * الخاص بك ، بعد تفاعل PCR ، فإن المنتج (الذي يشتمل الآن بالطبع على مواد التمهيدي الخاصة بك) سوف يتطابق بالفعل مع البادئات تمامًا. بعبارة أخرى ، لا يمثل عدم التطابق التمهيدي مشكلة & # 8217t * إذا * هم & # 8217 هم الذين تضخمت باستخدامهم.

من فضلك لا تحاول استخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز منتج PCR!
لا تستطيع مقاييس الطيف الضوئي النموذجية للمختبر قياس الكمية الصغيرة من الحمض النووي التي يولدها تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بأي دقة. ما لم تكن تمتلك واحدة من أحدث المواصفات الدقيقة (على سبيل المثال & # 8220Nanodrop & # 8221 أو ما شابه) ، يجب عليك ببساطة استخدام هلام agarose التحليلي لتقدير تركيز القوالب الخاصة بك. يرجى مقارنتها بجزء مرجعي من الحمض النووي بحجم مماثل وتركيز معروف!

تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) نادرًا ما تنتج نطاقات مفردة فقط.
قد تعتقد أن رد فعلك أنتج منتجًا واحدًا فقط ، ولكن غالبًا ما توجد أشياء أخرى هناك. عند استخدام هلام الاغاروز لتقييم نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكنك & # 8217t اكتشاف أي مما يلي:

  • المشكلة: منتجات صغيرة غير مشروعة
    التضخيم في موقع غير شرعي يؤدي إلى ظهور جزء صغير (& lt100 nt) لن يظهر أبدًا على هلام الاغاروز النموذجي 1٪ ، ولكنه سيتسلسل كثير أفضل من منتجك الأكبر & # 8216legitimate & # 8217.
    الحل: قم بترتيبها على أي حال. إذا رأيت قممًا متداخلة لأول 20-100 nt (خاصة إذا كانت كبيرة جدًا) ، فيجب أن تفترض وجود & # 8217s تداخلًا من منتج تضخيم صغير. إذا حصلت على التسلسل الذي تحتاجه على الرغم من المشكلة ، فهذا رائع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكنك دائمًا قطع النطاق المطلوب من هلام تحضيري ، أو الرجوع وإعادة تصميم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب هذا المنتج المتداخل. قد تحتاج إلى استخدام هلام الاغاروز بنسبة 2-3٪ لرؤية الأجزاء الصغيرة بشكل موثوق.
    ومع ذلك ، تحذير: يمكن أن تنتج هذه المنتجات الصغيرة مثل هذه الأشرطة الساطعة التي تسبب تداخلًا مع عينات شخص آخر في مكان قريب! إذا اشتكينا من عينات & # 8216overconcentrated & # 8217 ، فيرجى مراعاة ما إذا كانت الأجزاء الصغيرة تسبب مشاكل ، ويرجى عدم الاستمرار في إرسال مثل هذه العينات إذا كانت كذلك!
  • المشكلة: خلفية منتشرة منخفضة المستوى لمنتجات غير مشروعة
    عند تقييم نتيجة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انظر عن كثب إلى الجل التحليلي الخاص بك بحثًا عن مسحة خلفية قاتمة لتلطيخ بروميد الإيثيديوم. إذا كان هناك & # 8217s ، فمن المحتمل أنه & # 8217s DNA ، و (لأنه & # 8217s موزعًا ومنتشرًا) من المحتمل أن يكون هناك الكثير من الحمض النووي في العديد من نطاقات PCR. يمكن أن يشتمل بسهولة على غالبية الحمض النووي في عينتك ، وقد تكون نتيجة التسلسل سيئة للغاية.
    الحل: حسنًا ، يمكنك التسلسل بأي حال من الأحوال رخيص جدًا هذه الأيام. إذا رأيت عدة قمم متراكبة بدلاً من التسلسل النظيف ، فأنت بحاجة إلى تنظيف منتجك أكثر. قم بقطع الشريط المطلوب من هلام تحضيري ، أو ارجع وأعد تصميم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب هذا المنتج المتداخل.
  • المشكلة: إن & # 8220single & # 8221 عبارة عن منتجين متراكبين بالفعل
    إنه & # 8217s مفاجئًا ، لكن هذا ليس حدثًا نادرًا بشكل خاص. كل شيء يبدو رائعًا ، ولكن عندما تقوم بتسلسله ، كل ما تراه هو تسلسلات متعددة متراكبة. قد يحدث هذا إذا كنت تقوم بتضخيم اثنين من الجينات ذات الصلة & # 8211 ولكن غير متطابقة & # 8211 ، أو إذا كان لديك مسلك البوليمر المتجانس (مثل poly-A أو poly-T الذي يتسبب في جعل البوليميراز & # 8216 stutter & # 8217 ، أو ببساطة أنك كنت غير محظوظ.
    الحل: إذا كان لديك طريقة ما لإثبات أنك قمت بتضخيم المنتج الصحيح فقط ، فإن الأمر يستحق دائمًا الجهد المبذول للقيام بذلك. لا تفترض فقط أن الحجم الصحيح يعني النطاق الصحيح. على سبيل المثال ، إذا كنت تعرف موقع تقييد داخل جزء PCR المتوقع ، فقم بقص منتج PCR وتحقق من حصولك على الجزء (الأجزاء) المتوقعة. إذا كانت هناك نطاقات غير متوقعة أو أحجام أو أحزمة غير متوقعة لا تقطع ، فاحذر من هوية منتجك أو نقاءه.
    يمكن أن يؤدي استخدام بادئات PCR المتداخلة إلى تقليل هذه المشكلة. من غير المرجح أن يتضخم منتج غير شرعي من خلال جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة داخليًا.

تبدو كئيبة بعض الشيء ، أليس كذلك؟ ليس بالضرورة. هناك بعض الأسباب الوجيهة التي قد ترغب في المضي قدمًا فيها والتسلسل مباشرةً من منتج PCR. هنا بعض:

التسلسل المباشر أسرع بكثير. إذا كنت & # 8217re تفحص مئات عينات المرضى بحثًا عن طفرات في الجين ، فأنت لا تريد أن تنقي كل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالهلام ، ولا ترغب بالتأكيد في استنساخها جميعًا قبل التسلسل.

لا يُظهر التسلسل المباشر & # 8217t أي طفرات في تفاعل البوليميراز المتسلسل. تولد بروتوكولات PCR الشائعة (بوليميراز Taq في ظل ظروف ركوب الدراجات القياسية) عمليات دمج خاطئة من حين لآخر (حوالي مرة واحدة لكل 3 كيلو بايت ، في يدي). إذا قمت باستنساخ منتجات PCR وتسلسل العديد منها ، فأنت إرادة انظر الطفرات النقطية في بعض الحيوانات المستنسخة.

إذا قمت بالتسلسل المباشر لمنتج PCR ، فإن ما تراه & # 8217ll هو ملف إجماع قاعدة في كل موضع. على الرغم من أن العديد من المنتجات الفردية تحتوي على نيوكليوتيدات طافرة ، إلا أن هذه الطفرات مبعثرة عشوائيًا وتختلف لكل جزء منتج فردي. وبالتالي ، في أي واحد النوكليوتيدات ، ستكون معظم الحيوانات المستنسخة صحيحة ، وستشاهد التسلسل الأصلي بدون طفرات.

لدينا العديد من العملاء الذين نجحوا في تسلسل آلاف & # 8211 حتى عشرات الآلاف & # 8211 من منتجات PCR ، مع نتائج رائعة. انتقد جودة منتج PCR الخاص بك ، وإذا لزم الأمر ، قم بتحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتنقية الهلام للجزء المطلوب. أثبت أن لديك الجزء الصحيح قبل أن تستثمر في التسلسل واسع النطاق ، وستكون سعيدًا بالنتائج.


تفسير التسلسل اللوني

تقوم أجهزة تسلسل الحمض النووي الآلي بإنشاء مخطط كروماتوجرافي بأربعة ألوان يعرض نتائج تشغيل التسلسل ، بالإضافة إلى أفضل تخمين لبرنامج الكمبيوتر في تفسير تلك البيانات & # 8211 ملف نصي لبيانات التسلسل. ومع ذلك ، فإن برنامج الكمبيوتر هذا يرتكب أخطاء وتحتاج إلى إعادة التحقق يدويًا من تفسير البيانات الأولية. تحدث الأخطاء المتوقعة بالقرب من البداية ومرة ​​أخرى في نهاية أي تشغيل تسلسلي. يمكن أن تظهر أخطاء أخرى في الوسط ، مما يؤدي إلى إبطال المكالمات الأساسية الفردية أو مجموعات كاملة من البيانات.
يشرح هذا المستند كيفية فحص عادي كروماتوجرام تسلسل الحمض النووي ، الذي يصف القضايا الشائعة وكيفية تفسيرها. يتم توفير الروابط أيضًا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل أكثر اكتمالاً.
تقع على عاتق عملاء Core مسؤولية:

يعكس الإصدار الحالي من هذا المستند جيلنا الحالي من متواليات الحمض النووي ، نموذج ABI 3730XL. من حين لآخر ، ستشير المعلومات الواردة في هذا المستند إلى أجهزة التسلسل القديمة لأغراض تاريخية ، وسنذكر على وجه التحديد عندما يكون هذا هو الحال.

بقليل من الممارسة ، يمكنك مسح مخطط كروماتوجرام ضوئيًا في أقل من دقيقة وتحديد المشكلات. ليس من الضروري قراءة كل قاعدة.

1. احصل على فكرة عامة عن كيفية تنظيف التسلسل

ما مدى وضوح قمم النوكليوتيدات بشكل عام؟ يجب أن ترى قممًا متباعدة بشكل متساوٍ ، ولكل منها لون واحد فقط. قد تختلف ارتفاعات الذروة بمقدار 3 أضعاف ، وهو أمر طبيعي. & # 8220Noise & # 8221 (خط الأساس) قمم قد تكون موجودة ، ولكن مع قالب جيد وتمهيدي ، ستكون ضئيلة للغاية. إذا كانت نتائجك لا تتناسب مع هذا الوصف ، فاستشر صفحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. هنا & # 8217s مثال على التسلسل الممتاز. لاحظ القمم المتباعدة بشكل متساوٍ وعدم وجود خط الأساس & # 8216 الضوضاء & # 8217 (انظر أدناه للحصول على أمثلة للضوضاء الأساسية الأعلى):

يحتوي المثال التالي على القليل من الضوضاء الأساسية ، ولكن لا يزال من السهل الاتصال بالقمم & # 8216real & # 8217 ، لذلك لا توجد مشكلة في هذا النموذج:

نصل الآن إلى مثال به القليل من الضوضاء. لاحظ القمم متعددة الألوان عند 271 و 273 و 279 ، والقمم الخلالية المتباعدة بشكل غريب بالقرب من 291 و 301 ، ومن المستحيل تحديد النوكليوتيدات الحقيقية عند 310.

تنشأ ضوضاء مثل المذكورة أعلاه عندما تكون العينة نفسها قاتمة للغاية. تحقق من & # 8216 كثافة الإشارة & # 8217 أرقام كروماتوجرامك. عادة ما تكون متاحة في نافذة سحب منفصلة عبر برنامج عرض الكروماتوجرام الخاص بك ، أو إذا قمت بطباعة مخطط الكروماتوجرام ، فقد تتم طباعتها في الأعلى. فيما يلي بعض الأمثلة على أرقام قوة الإشارة ، والتي تعكس وحدات الفلورة التعسفية & # 8220 النسبية & # 8221:


الملخص

مقدمة: يتميز سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) بدورة سريرية غير متجانسة. في الوقت الحالي ، تحدد الحالة الطفرية لمنطقة متغير الجلوبيولين المناعي الثقيل (IgHV) مجموعتين من المخاطر: المرضى الذين يعانون من اختلاف 2 ٪ من السلالة الجرثومية يعتبرون غير متطفلين (UM) ولديهم تشخيص ضعيف بينما يلاحظ العكس بالنسبة للطفرة (M). ) المرضى (هامبلين وآخرون ، 1999). حتى الآن ، تم تحديد الاستنساخ باستخدام PCR / هلام الكهربائي والنسبة المئوية لطفرات IgHV عن طريق تسلسل Sanger باستخدام طريقة Biomed-2 (van Dongen ، Leukemia 2003) التي تسمح فقط بتحليل الاستنساخ الرئيسي وتفترض أن استنساخ واحد فقط لكل ينبغي النظر في المريض.

أساليب: في هذه الدراسة ، قمنا بتسلسل الجين IgHV لـ 200 مريض CLL بمتوسط ​​متابعة 70 شهرًا (المدى ، 1-309) من قبل الجيل التالي (NGS) وتسلسل Sanger (SS) وبحثنا في التأثير على تشخيص المرض. المجموعات الفرعية المختلفة. باختصار ، تم تضخيم 100 نانوغرام من (كدنا) المتولدة من الحمض النووي الريبي المستخرج من خلايا CD19 عالية النقاء التي تم الحصول عليها عند التشخيص باستخدام الخلطات الرئيسية لـ IGH LEADER. بالنسبة لـ SS ، تم تحديد استنساخ منتج PCR وتسلسل العينات أحادية النسيلة مباشرة. بالنسبة إلى NGS ، تم تنقية منتجات PCR باستخدام خرز مغناطيسي ، وتم تطبيعها وتجميعها لإنشاء مكتبة للتسلسل باستخدام مجموعة كاشف MiSeq v3 (600 دورة). تم تحليل بيانات التسلسل باستخدام برنامج المعلومات الحيوية LymphoTrack ™ واستندت النسبة المئوية للاستنساخ إلى أول 200 استنساخ تم اكتشافه بكثرة. لم يتم النظر في النسخ التي تحتوي على وفرة من & lt 2.5٪. تم استخدام قاعدة بيانات IMGT لحساب النسبة المئوية للطفرة مقارنة بالخط الجرثومي.

نتائج: باستخدام SS ، كان 49 ٪ (98/200) من المرضى IgHV M ، و 38 ٪ (76/200) UM ، بينما كان 13 ٪ (26/200) متعدد النواقل وكان تسلسل سانجر الإضافي غير حاسم. كان التوافق بين SS و NGS 98.3 ٪: بالنسبة إلى 90.2 ٪ ، كان الاستنساخ الرئيسي الذي تم اكتشافه بواسطة NGS هو نفسه بواسطة SS ، بالنسبة لـ 8.5 ٪ كان الاستنساخ هو نفسه ولكن النسبة المئوية للطفرة مقارنة بالخط الجرثومي اختلفت قليلاً مع متوسط ​​خطأ 0.6 ٪ ، بينما بالنسبة لـ 1.7 ٪ ، اكتشف SS استنساخًا آخر كان أقل وفرة بواسطة NGS. ومن المثير للاهتمام ، أنه من بين المرضى الذين اعتبرهم SS أحادي النسيلة ، وجد أن 25.3 ٪ (44/174) متعدد النسيلة بواسطة NGS. كشفت NGS أن 35٪ (70/200) من المرضى يظهرون إعادة ترتيب مختلفة لـ IgHV في نفس المريض: كان متوسط ​​التكرار لأول نسختين الأكثر وفرة 78.2٪ (النطاق ، 28.5-94.9) و 16.4٪ (المدى ، 2.5) -49.0) على التوالي. هذا يعني أنه على الأقل في هؤلاء المرضى ، يجب أن تحدث الأحداث البادئة لسرطان الدم قبل إعادة ترتيب IgHV في خلية pro-B. ستكون هناك حاجة لمزيد من الدراسات المتعمقة حول HSC والمقصورات الأولية للخلايا B في هؤلاء المرضى لتأكيد هذه الملاحظات. من حيث التشخيص ، كان لدى مرضى M و UM و polyclonal الذين تم تحديدهم بواسطة SS متوسط ​​بقاء خالٍ من العلاج (TFS) من 178 و 29 و 129 شهرًا على التوالي (P & lt0.0001) ومتوسط ​​بقاء إجمالي (OS) يبلغ & gt309 و 183 و & GT309 شهور (P & lt0.0001). نظرًا لأن NGS كانت قادرة على تمييز الحيوانات المستنسخة المختلفة ، فقد تمكنا من إنشاء 5 فئات مختلفة: المرضى الذين لديهم (أ) نسخ M متعددة ، (ب) استنساخ 1 M ، (ج) مزيج من استنساخ M-UM ، (د) 1 UM استنساخ ، (هـ) نسخ متعددة من UM. باستخدام تصنيف NGS الجديد هذا ، وجدنا مرضى لديهم تشخيص مختلف بين المرضى المصنفين بالفعل بواسطة SS. على سبيل المثال ، تم تصنيف مرضى SS-M في 3 مجموعات فرعية بمتوسط ​​TFS يبلغ 251 (أ) ، 178 (ب) ، 56 (ج) شهرًا (P = 0.0014). ولوحظت نتائج مماثلة لمرضى SS-UM الذين تم تقسيمهم إلى 3 مجموعات فرعية بمتوسط ​​TFS من 94 (ج) و 24 (د) و 19 (هـ) شهرًا (P = 0.0296). عندما يتم أخذ جميع المرضى في الاعتبار ، فإن تصنيف IgHV-NGS مقسم إلى طبقات في 5 مجموعات فرعية مختلفة بمتوسط ​​TFS يبلغ 251 (أ) ، 178 (ب) ، 57 (ج) ، 24 (د) ، 19 (هـ) شهرًا (P & lt0.0001) ونظام تشغيل متوسط ​​يبلغ 270 ، & GT309 ، & GT309 ، 183 ، 88 شهرًا (P & lt0.0001).

الاستنتاجات: إن تحديد حالة الطفرات IgHV بواسطة NGS له توافق ممتاز مع SS الكلاسيكي بالإضافة إلى أنه يتيح اكتشاف الحيوانات المستنسخة الصغيرة التي لها تأثير كبير على التشخيص. هذا يسمح بتحليل جميع الحيوانات المستنسخة دون معالجات كثيفة العمالة خاصة بالنسبة للمرضى متعددي الخلايا. أظهرنا هنا لأول مرة أن ثلث مرضى CLL يتواجدون مع نسائل فرعية IgHV متعددة تؤثر على التشخيص وتنقح تصنيف SS-IgHV السابق.


علم الجينوم المقارن: الحاجة إلى المزيد من جديد تسلسل الجينوم

تبدو حقيقة وجود 279 جينومًا بكتيريًا كاملاً في قواعد البيانات العامة (في وقت كتابة هذا التقرير) مثيرة للإعجاب ، لكن التقديرات الحديثة تشير إلى أنه يمكن أن يكون هناك 10 7 أصناف بكتيرية مميزة في 10 جرام فقط من التربة البكر (Curtis and Sloan، 2005 Gans et al.، 2005) لذلك لا توجد بيانات عن تسلسل الجينوم بالنسبة للغالبية العظمى من الميكروبات. بالنسبة للأنواع القليلة "المحظوظة" التي تم اختيارها للتحليل الجيني ، يوجد عادة جينوم مرجعي واحد فقط.

بالنسبة لعدد قليل من الميكروبات المسببة للأمراض ، تم ترتيب العديد من الأنواع ، وأظهرت البيانات من هذه الدراسات أن جينومًا مرجعيًا واحدًا ، على الرغم من كونه مفيدًا ، قد يعطي لمحة سريعة عن التركيب الجيني لأحد الأنواع. دراسة حديثة للمجموعة ب العقدية كشفت سلالات (Tettelin et al. ، 2005) أنه مع تسلسل كل سلالة جديدة ، تم اكتشاف جينات جديدة بحيث ، بعد تسلسل ثمانية جينومات ، تم اكتشاف ما يقرب من 33 جينًا جديدًا من كل جينوم إضافي. وقد أدى هذا إلى مفهوم "بان جينوم" ، والذي يشير إلى ذخيرة الجينات الكاملة الموجودة داخل النوع. تتنبأ نظرية عموم الجينوم بأن أي نوع من البكتيريا سوف يتكون من مجموعة أساسية من الجينات الموجودة في جميع الأفراد ومجموعة من الجينات التي يمكن الاستغناء عنها والتي قد تكون أو لا تكون موجودة في أي فرد معين (ميديني وآخرون ، 2005 Tettelin وآخرون ، 2005). يبدو أن هذه الظاهرة قابلة للتطبيق على معظم الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تم فحصها ، ودراسات التهجين الطرحي لـ بكتريا قولونية تشير إلى أن ما يصل إلى 25٪ من الجينوم خاص بالسلالات الفردية (Fukiya et al. ، 2004). من خلال تسلسل المزيد والمزيد من الأفراد ، يمكن تقدير حجم عموم الجينوم. وذلك ل عصيات الجمرة الخبيثة، لم يتم تحديد المزيد من الجينات الجديدة بعد تسلسل أربعة أنواع بينما بالنسبة للمجموعة ب العقدية و بكتريا قولونية تشير التقديرات إلى أن عدد السلالات اللازمة لمسح الجينوم الشامل هو على الأقل بالمئات وقد يكون بشكل فعال غير محدود. من النتائج المهمة من هذا العمل أنه بالنسبة للعديد من الأنواع ، قد تكون مجموعة الجينات التي يمكن الاستغناء عنها أكبر بكثير من الجينوم الأساسي. لذلك ، قد يعطي جينوم واحد تمثيلًا ضعيفًا جدًا للإمكانات الجينية للأنواع. عند التنبؤ بفرصة ظهور مقاومة للأدوية أو أشكال خبيثة جديدة من مسببات الأمراض ، فإن معرفة التكامل الجيني الكامل للأنواع أكثر أهمية بكثير من التكملة الجينية للفرد.

لا يسمح المزيد من الجينومات باكتشاف المزيد من الجينات فحسب ، بل إنها تساعدنا أيضًا على فهم كيفية تطور الجينات والجينومات ، حيث يمكن أن يوفر ذلك أدلة على وظيفة الجينات. غالبًا ما تخضع جينات الممرض التي تتفاعل مع العائل للاختيار الإيجابي (وبالتالي يبدو أنها تتطور بسرعة). تم تطبيق دراسات التطور الجزيئي على مستوى الجينوم على مسببات الأمراض المختلفة مثل المتصورة(هول وآخرون ، 2005) ، المثقبيات (السيد وآخرون ، 2005) ، بوريليا (Qiu et al. ، 2004) والعديد من الأنواع الأخرى. تعتمد هذه الدراسات على تتبع نمط الطفرات التي تحدث في المواقع المترادفة وغير المترادفة من خلال محاذاة الجينات المتعامدة في الأنواع ذات الصلة الوثيقة. كلما زاد عدد الجينومات التي يمكن مواءمتها ، كان هذا التحليل أكثر دقة. استخدمت الدراسات حتى الآن ما يصل إلى أربعة جينومات في وقت واحد ، ولكن نظرًا لأن التسلسل أصبح في متناول الجميع ، سيكون من الممكن توسيع نطاق هذا التحليل للنظر في عشرات أو مئات الجينومات في وقت واحد.


حالة الطفرات Ighv من خلال تسلسل الجيل التالي العميق يحسن تصنيف تسلسل Ighv Sanger في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن

أزهارا فوينتيس ، أليسيا سيرانو ، بلانكا فيرير لوريس ، فيرونيكا ليندينيز ، كارولينا مونزو ، كارمن إيفورا ، مار تورمو ، ماريا خوسيه تيرول ، بلانكا نافارو ، خافيير إف تشافيز إيغف ، الحالة الطفولية من خلال تسلسل الجيل التالي العميق ينقح تصنيف تسلسل إيغف سانجر في المرضى الذين يعانون من الخلايا الليمفاوية المزمنة سرطان الدم. دم 2019134 (ملحق_1): 3028. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2019-129145

مقدمة: يعتبر تحديد الحالة الطفرية لجينات الجلوبيولين المناعي المتغير ثقيل السلسلة (IgHV) المعاد ترتيبها في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) أحد أهم العوامل الإنذارية: المرضى الذين يعانون من IgHV غير المطير (UM 98 ٪ من الهوية إلى السلالة الجرثومية) لديها مسار مرض أكثر عدوانية وتحدث عمليات حذف أو طفرات جينية غير مواتية بشكل متكرر أكثر من المرضى الذين يعانون من IgHV الطافر (M ≤98 ٪). الحالة الطفرية ، يتم تحديدها حاليًا من خلال تسلسل Sanger (Sseq) الذي يسمح بتحليل الاستنساخ الرئيسي ، ومع ذلك ، توصي الإرشادات الدولية بالحذر في تعيين حالة الطفرات في الحالات ذات هوية IgHV "الحدودية" (97-97.9٪) ، والحالات ذات إعادة ترتيب مع حالة الطفرات المتضاربة.

الهدف: تحليل وتحديد الحالة الطفرية لموضع IgHV عن طريق التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) ، في مجموعة من مرضى CLL (ن = 51) مع نتائج Sseq غير قابلة للتصنيف: حالة الحدود (ن = 22) إعادة ترتيب مزدوجة (ن = 27 ) مع حالة طفرة متنافرة (ن = 2).

الطريقة: قمنا بتضمين 51 عينة من الحمض النووي المستخرجة من الدم المحيطي للمرضى الذين تم تشخيصهم بالـ CLL وفقًا لإرشادات مجموعة عمل المعهد الوطني للسرطان في مؤسستنا بين عامي 1986 و 2019 (متوسط ​​الخلايا الليمفاوية المطلقة 11.4x10 9 / لتر [2،8-239،5x10 9 / L]).

تم إجراء تضخيم Sseq وتحليل إعادة ترتيب IgHV على الحمض النووي المطابق لتوصيات ERIC المحدثة. في جميع الحالات تمكنا من تحديد هوية IGVH.

لتبديل التسلسل عالي الإنتاجية إلى الممارسة السريرية ، قمنا بتقييم موثوقية طرق إعداد المكتبة المختلفة لتسلسل موضع IGH في المرضى الذين يعانون من CLL. تم إجراء التضخيم باستخدام مجموعة Sequencing Multiplex Kit بناءً على IGH FR (بادئات أمامية) وتوافق الآراء JH (التمهيدي العكسي). تم تنقية منتجات PCR باستخدام حبات مغناطيسية Magsi-NGS Prep (Magnamedics Diagnostics) ، تم تطبيعها وتجميعها لإنشاء مكتبة للتسلسل باستخدام جهاز MiSeq. لتبسيط التحليل وإجراء التحليل التلقائي لنفسه ، قمنا بتطوير خط أنابيب خاص بالمعلومات الحيوية يغطي من المعالجة المسبقة إلى تلخيص البيانات النهائية وتفسيرها. يشتمل العمود الفقري للتحليل على معالجة مسبقة للقراءة ، ورسم خرائط مقابل تسلسلات مرجعية IMGT ، ويقرأ إجماع IgHV المحاذاة الزوجية لتحديد حالة الطفرات وقراءة التصنيف في عمليات إعادة الترتيب.

النتائج: أدى هذا النهج إلى تحديد IgHV المستنسخ السائد في جميع الحالات (ن = 51). بدلاً من ذلك ، تختلف النسبة المئوية للهوية المحسوبة بواسطة تحليل HTS في:

- 15/22 حالات حدودية يمكن إعادة حساب حالتها الطفرية إلى 10 MM و 5 UM. البقية السبعة المتبقية في المجموعة الحدودية.

- يمكننا تحديد كلا النسختين في 29 حالة إعادة ترتيب مزدوجة ، مع حالة طفرة متوافقة باستثناء 2/29 حالة غير محددة ، متضمنة في مجموعة UM فيما يتعلق بنتائج HTS.

أدت أداتنا إلى تحديد IgHV السائد في جميع الحالات ، وعند مقارنة تسلسل HTS / الحالة الطفرية للنسخة الأكثر وفرة مع Sseq ولتحديد حالة IgHV ، يمكن 15 من 22 (68،18٪) يتم إعادة تصنيفها. أظهرت هذه الحالة استنساخًا رئيسيًا مع إعادة ترتيب مثمرة تم تحويرها بواسطة Sseq ولكن دون تغيير بواسطة HTS.

الاستنتاجات: تحليل وتحديد الحالة الطفرية لموضع IgHV بواسطة HTS ، من المحتمل أن تكشف عن عمليات إعادة ترتيب متعددة وتزيد من الدقة النذير لتحليل طفرة IgHV. تصنيف IgHV-HTS قادر على التصنيف الدقيق للمرضى الذين يعانون من حالة حدودية و / أو إعادة ترتيب IgHV متعددة والتي يكون Sseq غير حاسم لها. في هذه الحالة ، كان من الممكن تحسين التكهن لـ 17 من أصل 24 مريضًا. يساعدنا هذا في اكتشاف مزايا البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة HTS مقارنة بتقنية Sseq القياسية الحالية.

تم توفير العينات من قبل INCLIVA Biobank. بتمويل من Gilead Felowship 257/17

تيرول:أبفي: الاستشارات يانسن: الاستشارات ، تمويل البحوث جلعاد: تمويل البحوث روش: الاستشارات أسترا زينيكا: الاستشارات.


تحليل الحمض النووي

يتم التحقق من بناء البلازميد المؤتلف بشكل أكثر شيوعًا عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة و / أو الهضم المقيد و / أو تسلسل سانجر. توفر كل طريقة من طرق التحليل هذه نوعًا معينًا من المعلومات حول التركيبات البلازميدية الحديثة الصنع والتي تتراوح من وجود أو عدم وجود ملحق إلى بيانات التسلسل الكامل للحمض النووي المُدرج.


تعد Colony PCR طريقة سريعة وعالية الإنتاجية لفحص مستعمرات متعددة في وقت واحد لوجود وتوجيه إدخال دون تنقية DNA البلازميد. تستخدم المواد الأولية التي تستهدف إما ناقل DNA الذي يحيط بجين الإدخال ، أو الجين المعني ، أو مزيج من الاثنين لتضخيم جزء من DNA البلازميد. يتم حل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لاحقًا على هلام الاغاروز بمعايير الحجم لاكتشاف وجود أو عدم وجود إدخال وحجم أمبليكون PCR.

يوفر الهضم المقيد للبلازميدات المؤتلفة أداة تشخيص سريعة للتحليل المتزامن للبلازميدات المتعددة ، بناءً على عدد وموقع مواقع التقييد على طول الحمض النووي. تتم مقارنة أنماط هضم البلازميدات المؤتلفة المقطوعة باستخدام إنزيمات تقييد مختارة مع الأنماط المتوقعة لتأكيد تسلسل الإدراج والتوجيه ويمكن أن توفر معلومات حول تنوع مكتبات النسخ المعقدة.

يتم استخدام تسلسل Sanger لبنى البلازميد لتحليل تسلسل الحمض النووي للإدراج والوصلات بين المتجه والإدراج. بالنسبة للتطبيقات النهائية ، مثل تعبير البروتين ، والتعبير الجيني ، و / أو التحليل الوظيفي ، التي تتطلب ترجمة مناسبة لإطار قراءة مفتوح داخل الإدخال ، من الضروري التأكد من أن جين الإدخال قد تم ربطه في موضع القاعدة المخطط بدقة داخل العمود الفقري المتجه. إذا لزم الأمر ، يمكن تحليل الملحق بالكامل عن طريق تسلسل Sanger باستخدام كل من المتجهات المحددة وإدراج بادئات محددة.

يعتمد اختيار طريقة التحليل المراد استخدامها على كمية المعلومات المطلوبة ، وغالبًا ما يمكن استخدام هذه الأساليب مع بعضها البعض. على سبيل المثال ، يمكن فحص المستعمرات الفردية أولاً بواسطة PCR للمستعمرة لتحديد تلك التي تحتوي على إدراج وتضمن تحليلًا إضافيًا بواسطة تسلسل Sanger. يوفر الهضم المقيد بيانات تسلسل غير مباشر للبلازميد المؤتلف ، دون وقت الانتظار المرتبط بتسلسل سانجر.

اختر النوع:

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.


مدونة CD Genomics

استكشف المدونة التي قمنا بتطويرها ، بما في ذلك تعليم الجينوم ، وتقنيات الجينوم ، والتطورات الجينية ، وأخبار وآراء الجينوميات.

تسلسل سانجر: مقدمة ومبدأ وبروتوكول

ما هو تسلسل سانجر؟

تم تطوير تسلسل سانجر ، المعروف أيضًا باسم & # 8220chain إنهاء طريقة ، & # 8221 من قبل عالم الكيمياء الحيوية الإنجليزي فريدريك سانجر وزملاؤه في عام 1977. هذه الطريقة مصممة لتحديد تسلسل قواعد النوكليوتيدات في قطعة من الحمض النووي (عادةً أقل من 1000 نقطة أساس). يعتبر تسلسل Sanger بدقة أساسية بنسبة 99.99٪ هو المعيار & # 8220gold & # 8221 للتحقق من تسلسل الحمض النووي ، بما في ذلك التسلسل المتسلسل بالفعل من خلال تسلسل الجيل التالي (NGS). تم استخدام تسلسل سانجر في مشروع الجينوم البشري لتحديد تسلسل أجزاء صغيرة نسبيًا من الحمض النووي البشري (900 نقطة أساس أو أقل). تم استخدام هذه الشظايا لتجميع شظايا DNA أكبر ، وفي النهاية ، كروموسومات كاملة.

تسلسل سانجر VS NGS

أدى تطوير تقنيات NGS إلى تسريع أبحاث الجينوم. يمكن لـ NGS تسلسل أكثر من 100 جين وجينوم كامل في وقت واحد باستخدام DNA منخفض المدخلات. لا يزال تسلسل سانجر مستخدمًا على نطاق واسع في مجال التسلسل لأنه يوفر العديد من المزايا البارزة: (1) كفاءة التكلفة لتسلسل الجينات الفردية و (2) دقة 99.99 ٪ ، ومناسبة بشكل خاص لتسلسل التحقق من الطفرات الموجهة للموقع أو الإدخالات المستنسخة.

كيف يعمل تسلسل سانجر؟

في تسلسل Sanger ، يتم استخدام أساس تمهيدي DNA مكمل لقالب DNA (الحمض النووي الذي سيتم تسلسله) ليكون نقطة انطلاق لتخليق DNA. في وجود أربعة ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs: A و G و C و T) ، يقوم البوليميراز بتمديد التمهيدي عن طريق إضافة dNTP التكميلي إلى قالب DNA. To determine which nucleotide is incorporated into the chain of nucleotides, four dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, and ddTTP) labeled with a distinct fluorescent dye are used to terminate the synthesis reaction. Compared to dNTPs, ddNTPs has an oxygen atom removed from the ribonucleotide, hence cannot form a link with the next nucleotide. Following synthesis, the reaction products are loaded into four lanes of a single gel depending on the diverse chain-terminating nucleotide and subjected to gel electrophoresis. According to their sizes, the sequence of the DNA is thus determined.

Figure 1. The structure of ddNTP and dNTP.
Image credit: “Whole-genome sequencing: Figure 1,” by OpenStax College, Biology).

Sanger Sequencing Steps

The Sanger sequencing method consists of 6 steps:
(1) The double-stranded DNA (dsDNA) is denatured into two single-stranded DNA (ssDNA).
(2) A primer that corresponds to one end of the sequence is attached.
(3) Four polymerase solutions with four types of dNTPs but only one type of ddNTP are added.
(4) The DNA synthesis reaction initiates and the chain extends until a termination nucleotide is randomly incorporated.
(5) The resulting DNA fragments are denatured into ssDNA.
(6) The denatured fragments are separated by gel electrophoresis and the sequence is determined.

Figure 2. The Sanger sequencing method in 6 steps (adapted from Gauthier 2008).


شكر وتقدير

This work was supported by grants from the National Natural Science Foundations of China (grant numbers: 31472216, 31402226). We also thank BGI-Shenzhen for MiSeq sequencing.

Authors’ contributions

Conceived and designed the experiments: MFF, DX. Performed the experiments: LYN, ZYJ, LYY. Analyzed the data: HT. Contributed reagents/materials/analysis tools: CS. Wrote the paper: MFF, DX. Checked and revised the manuscript: ZP, CZZ. All authors read and approved the final manuscript.


شاهد الفيديو: طريقة سانجر لمعرفة تتابعات الـ DNA الجزء الأول (شهر فبراير 2023).